摘要
羔皮性状是湖羊特色、优质性状，羊毛弯曲度是影响羔皮品质的关键因素，但调控羊毛弯曲度的分子机制尚不清楚。已有研究表明毛囊内根鞘结构及内根鞘角蛋白基因的变异会影响毛发弯曲。同时小鼠上有研究表明同源框CUT样蛋白1(CUT-likehomeobox1，CUX1)在毛囊内根鞘中特异性表达，其可以控制内根鞘分化，进而影响毛发弯曲。前期，课题组测序发现CUX1基因在湖羊大花、小花中差异表达，且在湖羊毛囊内根鞘上高表达，同时内根鞘角蛋白基因如角蛋白25(Keratin25，KRT25)、角蛋白71(Keratin71，KRT71)等也在湖羊大花、小花中差异表达。鉴于CUX1是在毛囊中发挥功能的重要转录因子，以及在线预测发现CUX1与KRT25、KRT71启动子区存在多个潜在结合位点，因此我们推测CUX1通过调控内根鞘角蛋白基因的表达，影响湖羊羊毛弯曲度，进而影响湖羊的羔皮性状。基于此，本研究的目的在于探究CUX1在湖羊不同花纹羔皮中差异表达的调控机制及其对毛囊内根鞘角蛋白基因的调控作用，以期阐明湖羊羔皮花纹性状形成的分子机制，为湖羊种质资源保护提供理论基础。主要研究结果如下: 1.湖羊CUX1核心启动子区鉴定与DNA甲基化分析 为了探究CUX1基因在湖羊不同花纹羔皮组织中差异表达与启动子区甲基化修饰的关系，首先构建CUX1启动子系列缺失载体，借助双荧光素酶报告系统筛选出湖羊CUX1启动子活性核心区域为-1601～-1bp。针对重要启动子区-1151～-1bp预测发现存在2处CpG岛，利用亚硫酸氢盐测序检测CUX1基因启动子区-821bp/-505bp在小花、直毛中甲基化水平。结果显示CpG岛-821bp/-505bp中存在41个CG位点，在小花、直毛羔皮组织中甲基化率均较低，该启动子区在小花、直毛中的甲基化水平差异不显著。以上结果表明，CUX1基因在湖羊不同花纹羔皮组织中的差异表达与CpG岛-821bp/-505bp的甲基化修饰无关。 2.转录因子Sp1、Krox20和C-MYC对湖羊CUX1基因的调控作用 为进一步探究CUX1基因在湖羊小花、直毛中差异表达的机制，首先预测了潜在的可能结合湖羊CUX1核心启动子区的转录因子，基于毛囊相关文献和RT-qPCR，选择转录因子Sp1、Krox20和C-MYC作为研究对象。然后，通过双荧光素酶报告系统和RT-qPCR检测过表达转录因子Sp1、Krox20和C-MYC对CUX1核心启动子区活性和CUX1mRNA表达量的影响。双荧光素酶报告系统结果表明，Sp1能够极显著提高CUX1核心启动子区活性(P＜0.01)，C-MYC能够显著提高CUX1核心启动子区活性(P＜0.05)，Krox20能够极显著抑制CUX1核心启动子区活性(P＜0.01)。RT-qPCR结果显示，过表达Sp1极显著提高CUX1mRNA表达量(P＜0.01)，过表达C-MYC后CUX1mRNA表达量升高但差异不显著，过表达Krox20使得CUX1mRNA表达量极显著下降(P＜0.01)。以上结果表明，Sp1和C-MYC正向调控CUX1核心启动子区活性并促进其mRNA表达，Krox20负向调控CUX1核心启动子区活性并抑制其mRNA表达。 3.转录因子CUX1对湖羊毛囊内根鞘角蛋白基因的调控作用 为了探究转录因子CUX1在湖羊毛囊生长发育中的潜在作用，首先通过PCR和RT-qPCR试验，并结合蛋白亚型分析，发现CUX1在湖羊毛囊中的重要功能剪切体为CUX1-X4。然后，基于RT-qPCR和转录因子结合位点预测，发现KRT25、KRT71是CUX1的候选靶基因。最后，构建湖羊KRT25、KRT71启动子系列缺失载体，借助双荧光素酶报告系统筛选出启动子活性核心区域，并检测过表达转录因子CUX1对湖羊毛囊内根鞘角蛋白基因KRT25、KRT71核心启动子区的调控作用。结果显示，过表达CUX1后，KRT25、KRT71核心启动子区活性均极显著升高(P＜0.01)。以上结果表明，转录因子CUX1正向调控湖羊KRT25、KRT71核心启动子区活性。 综上所述，本研究发现CUX1基因在湖羊不同花纹羔皮组织中的差异表达与CpG岛-821bp/-505bp的甲基化修饰无关，初步揭示了转录因子Sp1和C-MYC正向调控CUX1核心启动子区活性并促进其mRNA表达，Krox20负向调控CUX1核心启动子区活性并抑制其mRNA表达，以及转录因子CUX1正向调控湖羊KRT25、KRT71核心启动子区活性。本研究将为构建CUX1，调控湖羊毛囊发育的网络奠定理论基础，也为探索羔皮不同花纹形成机制提供新方向，进而为改良羊毛弯曲性状、提高湖羊羔皮品质提供一些参考。
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