摘要
乳脂是影响乳制品风味的重要因素，也是人类主要的营养来源之一。“生物钟”是一种使动物能够预测昼夜更替，从而主动地组织生理和行为的计时装置。先前的研究已经确定，牛奶脂肪含量存在昼夜节律性变化[1]，而乳脂的合成又受到脂肪酸代谢和部分信号通路的调控。乳腺上皮细胞中时钟基因旭船的敲除试验证明了这几者存在紧密的联系，但其中具体的调控机制尚不明确。因此，本研究直接测定了乳腺上皮细胞中时钟基因和致脂基因24h的积累模式，分析两者的相关性。并通过过表达乳腺上皮细胞PER2基因，检测相关致脂基因、蛋白的表达和细胞中脂肪酸变化，以探究PER2调控乳腺上皮细胞乳脂合成机制。 试验一、奶牛乳腺上皮细胞生物钟及乳脂代谢相关基因表达的日节律性 本部分通过复苏课题组前期采集的泌乳中期的荷斯坦原代奶牛乳腺上皮细胞(Bovinemammaryepithelialcells，BMEC)，待细胞生长稳定后，传代分为6组，每组3个以上重复，在相同环境下培养24h，每隔4h收集样品。以第一个时间点为CT0/CT24(Circadiantime，CT)，后续依次为CT4、CT8、CT12、CT16和CT20。利用qRT-PCR检测生物钟、脂肪酸代谢、核转录和相关信号通路基因的表达。结果表明，奶牛乳腺上皮细胞PER2基因的表达受到时间的影响，在6个时间点中差异显著(P＜0.01)。进一步拟合得到PER2昼夜积累公式:YPER2=2.670-1.774*cos(x+1.432)，R2=0.965。总共有9个生物钟基因(PER1/2、CRY1/2、REV-ERBα、BMAL1、NCOR1、NR2F2、FBXW11)、6个脂肪酸代谢基因(CD36、ACSS2、ACACA、SCD、FADS1、DGAT1、ADFP、XDH)、9个核受体和相关信号通路基因(INSIG1、SCAP、SREBF1、C/EBP、PPARG、LXR、PDK1、AKT1、TSC2)的表达可能存在近24h的昼夜节律。同时，我们发现REV-ERBα与INSIGmRNA的表达呈显著的负相关关系(r=-0.740，P＜0.01);PPARG与PER2(r=0.802，P＜0.01)、REV-ERBα(r=0.628，P＜0.01)mRNA的表达呈显著正相关，时钟基因可能通过影响核转录相关基因的表达调控乳脂代谢。 试验二、奶牛乳腺上皮细胞PER2基因过表达模型构建 本章节致力于构建奶牛乳腺上皮细胞中PER2基因过表达质粒。试验分为对照组(转染pcDNA3.1空质粒)和过表达组(转染pcDNA3.1-PER2质粒)。质粒构建完成后通过PCR测序、凝胶电泳、以及检测PER2基因和蛋白的过表达效率以确保质粒构建效果。并进一步检测PER2过表达对乳腺上皮细胞生物钟基因表达，以及对细胞本身增殖、凋亡和周期分布的影响。结果显示，通过腺病毒转染技术转染过表达奶牛乳腺上皮细胞24h后，PER2mRNA相对表达量提高至1290.78倍，相对蛋白丰度提高至1.78倍。PER2过表达抑制了核心时钟基因BMAL1和CLOCKmRNA的表达(分别为0.52倍和0.69倍)，提高了REV-ERBαmRNA的表达(1.62倍)，显著下调了钟控基因SIRT1、NCOR1和FBXW11mRNA的表达(分别为0.49倍、0.65倍和0.75倍)。同时，PER2过表达一定程度上降低了乳腺上皮细胞活细胞比例(91.73％与89.5％)，提高了DNA合成前期的细胞数量(61.12％与69.57％)，但整体变化较小，结合乳脂合成试验的结果，我们认为转染步骤未对细胞功能产生显著的不利影响。 试验三、PER2基因过表达对乳腺上皮细胞乳脂合成及代谢通路的影响 基于试验二PER2过表达质粒的构建成功，体外培养奶牛乳腺上皮细胞，同样分为对照组和过表达组，质粒转染24h后通过qPCR和WB检测致脂基因的相对表达量和蛋白的相对丰度，通过气相色谱-质谱法检测细胞脂肪酸的组成，通过甘油三酯酶法测定甘油三酯(Triglyceride，TAG)含量，油红O染色检测脂滴的分泌情况。结果显示，PER2过表达显著提高了乳腺上皮细胞甘油三脂的合成(提升36.8％)和脂滴的分泌(P＜0.05);显著上调了脂肪酸转运、甘油三酯合成和核转录因子编码基因mRNA的转录水平，包括乙酰辅酶A羧化酶ACACA(1.69倍)、硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD(1.33倍)、磷脂酸磷酸酶LPIN1(1.37倍)、二酰基甘油酰基转移酶DGAT1(1.35倍)、固醇调节元件结合蛋白SREBF1(3.46倍);同时，显著下调了脂肪酸结合蛋白FABP3和甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAMmRNA的转录水平(分别为0.48倍和0.55倍)。ACC、SCD、LPIN1、DGAT1和SREBP1mRNA转录水平的提高也通过其相对蛋白丰度的增加得到了验证，分别为对照组的1.51倍、1.32倍、1.32倍、1.45倍和1.57倍(P＜0.05)。脂肪酸检测的结果显示，过表达组棕榈酸(C16∶0)、油酸(C18∶ln9c)和反式油酸(C18∶ln9t)的含量和比例显著升高，乙酸、硬脂酸(C18∶0)、花生四烯酸(C20∶4n6)和芥酸(C22∶1n9)的含量和比例显著降低(P＜0.05)这些结果表明，PER2过表达后乳腺上皮细胞脂肪酸从头合成和去饱和途径增强。 综上，PER2可能通过正向调控内质网上固醇调节元件结合蛋白SREBP1的表达，促进脂肪酸从头合成、去饱和和甘油三脂合成的过程，从而改善乳腺上皮乳脂的合成以及脂肪酸的组成。
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