摘要
猪是我国最重要的经济动物之一，并且由于与人类在解剖学、遗传学、免疫学和生理学等方面都高度相似，成为研究人类复杂疾病的重要动物模型。然而相比人类免疫系统的研究，目前对猪的免疫细胞标记基因了解相对匮乏，并且关于猪的免疫细胞异质性也缺少系统性研究。此外，我国本土猪品种与引进西方商业化猪品种的抗逆性与抗病力存在显著差异，尽管近年也有一些研究，但中外猪品种间免疫特性差异的细胞与分子机制仍在很大程度上没有得到充分解析。 近年发展起来的单细胞测序技术能够在单细胞水平揭示细胞类群间的异质性，在免疫学等领域有着日益广泛的应用。猪外周血单个核细胞(PBMC)属于一群异质性免疫细胞群，主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞，对机体免疫至关重要，广泛用于免疫学研究及临床应用。本研究以PBMC为主要模式，应用单细胞转录组和表观组测序技术，针对猪免疫细胞的异质性和中外猪品种间免疫能力的差异开展研究。已有相关报道表明中国地方猪品种梅山猪与引进的商业化品种杜洛克猪对多种病原体的抗性存在差异，推测可能与品种间先天免疫特性的差异有关。因此本研究首先应用scRNA-seq技术对梅山猪与杜洛克猪的PBMC进行研究，以探索猪免疫细胞异质性与品种间免疫特性差异机制;同时，应用scATAC-scq技术对杜洛克猪PBMC进行单细胞水平的染色体可及性检测，以探索猪PBMC中异质性免疫细胞的调控网络;针对鉴定得到的单核细胞富集表达的转录因子CEBPD，进一步应用基因干扰、RNA-scq和ChIP-seq技术，探究其在单核巨噬细胞中的转录调控功能。本研究的主要结果概括如下: 1.基于梅山猪与杜洛克猪PBMC常规转录组测序分析品种间免疫差异机制 为了探究中国地方猪品种与欧洲商业化猪品种间免疫特性差异的潜在分子机制，本研究首先对梅山猪与杜洛克猪PBMC开展了常规转录组测序。基因差异表达分析鉴定了上千个差异表达基因，GO和KEGG富集分析表明梅山猪中表达上调的基因与免疫反应、免疫防御等生物过程与信号通路显著相关，GSEA分析也得到了相似的结果。之后，WGCNA联合差异表达基因分析筛选出61个枢纽基因(Hubgene)。通过对两组PBMC差异表达基因进行免疫浸润分析推断，相比杜洛克猪，梅山猪的单核细胞和嗜中性粒细胞比例较高，而T调控细胞比例较低。同时与WGCNA分析得到的Hub基因相关分析发现，高表达的基因与单核细胞和嗜中性粒细胞显著正相关，与T调控细胞显著负相关，而低表达的基因则与之相反。以上结果提示，梅山猪与杜洛克猪免疫特性差异与先天性免疫、免疫防御反应和免疫细胞分化等相关的基因紧密关联，并且与PBMC中免疫细胞组成差异可能也有着密切关系。 2.基于单细胞转录组测序分析梅山猪与杜洛克猪PBMC免疫细胞异质性 为了探究猪免疫细胞异质性及其与品种间免疫特性差异的关联，本研究应用scRNA-seq技术对梅山猪与杜洛克猪PBMC进行单细胞转录组测序。总共成功获得了63710个单细胞转录组图谱，聚类分析鉴定了20个细胞亚群，涵盖αβT细胞、γδT细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞和DC细胞等类群，并且针对每个细胞类群鉴定了数百个标记基因。有趣的是，猪PBMC的俩T淋巴细胞占比远高于人类和小鼠的比例，并且发现了有被称为记忆效应T细胞的CD4+CD8+双阳性T细胞。此外，与人类PBMC数据的整合比较表明，人类拥有一个独特的单核细胞亚群，并且其基因表达谱与近期发现的“Mono4”亚群相符。以上表明，虽然猪与人类免疫细胞类群总体相似，它们各自也具有一些独特的免疫细胞亚群。 梅山猪与杜洛克猪PBMC数据进一步比较显示，单核细胞和一个B细胞亚群(B1)在前者的比例偏高，而γδT和NK细胞在后者的比例偏高，表明2个品种间PBMC中免疫细胞组分上存在差异。此外，通过比较2个品种间各免疫细胞亚群的富集基因，发现梅山猪在单核细胞中高表达的基因显著与粒细胞趋化、对干扰素-γ和单核细胞迁移的反应等免疫功能密切相关，而杜洛克猪中高表达的基因与免疫功能的相关性不显著，并且还出现了免疫系统过程负向调节的不良功能;在γδT亚群中，发现梅山猪高表达的基因显著与T细胞分化、髓系淋巴细胞活化与适应性免疫系统等免疫功能密切相关;而在杜洛克猪高表达的基因显著富集到细胞粘附调控、成骨细胞分化调控与蛋白转运正调控等，也出现了免疫系统过程的负向调节的不良功能。与常规RNA-seq的结果一致，这些结果提示免疫细胞组成和基因表达模式是梅山猪与杜洛克之间免疫特性差异的基础。 3.基于单细胞ATAC测序数据分析猪PBMC中免疫细胞异质性 为了进一步了解猪免疫细胞的异质性，本研究对杜洛克猪PBMC进行了scATAC-seq，首次成功绘制了21855个单细胞染色质可及性图谱。基于scATAC-Seq数据猪PBMC被聚类19个亚群，其结构与来自scRNA-Seq数据细胞聚类相似;基于scRNA-Seq的细胞标记作为参考，其中16种亚群在scATAC-Seq数据中被成功注释，包含αβT细胞、γδT细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞和DC细胞等类群;但其他4个细胞亚群γδT2、CD8+T3、血浆和血小板可能由于它们在PBMC中的数量比例低未被注释到。进一步对每个细胞亚群peak峰进行了motif富集分析，揭示了猪PBMC中各细胞亚群显著富集的基序，其数量从83到633不等;其中包含一些已知对特定免疫细胞的发育很重要的转录因子，如B淋巴细胞的EBF1;单核细胞的SPI1、CEBP家族的CEBPA与CEBPD;在富含γδT亚群中的KLFs家族，包括KLF2、KLF3、KLF4、KLF5和KLF9等。本研究scATAC-seq数据有助于进一步解析猪PBMC中免疫细胞的异质性，并预测了与每个免疫细胞亚群相关的重要转录因子。 4.基于ChIP-Seq探究转录因子CEBPD在单核巨噬细胞的调控机理 本研究结合梅山猪与杜洛克猪品种间PBMC差异表达基因、PBMC中各免疫细胞亚群间差异表达基因及各免疫细胞调控的转录因子，我们推测CEBPD对单核细胞发育与免疫调控功能起至关重要作用，可能参与品种间免疫特性差异的调控。因此，初步筛选出在单核细胞中富集的基因CEBPD及转录因子CEBPD，探究其在单核巨噬细胞中的调控机制。本研究在人单核细胞(THP-1)和猪肺泡巨噬细胞(3D4/12)上通过对CEBPD基因在mRNA水平和蛋白水平进行干扰，进行RNA-seq获得CEBPD敲降后单核细胞与巨噬细胞的基因表达模式，发现其干扰后单核巨噬细胞基因表达变化涉及多种疾病免疫相关的信号通路，如神经性退化通路多种疾病、阿尔茨海默病、人乳头瘤病毒感染、MAPK信号通路、单纯疱疹病毒1型感染等疾病免疫相关通路。联合CEBPD在THP-1和3D4/12上的ChIP-seq分析结果，揭示了其干扰后基因表达模式的变化，同时鉴定出CEBPD在单核巨噬细胞直接调控的靶基因，构建了CEBPD在单核细胞与巨噬细胞的转录调控网络。 综上所述，本研究提高了对猪免疫细胞异质性的认识，解析了中外猪品种间免疫特性差异与免疫细胞的异质性密切关系。本研究中确定的细胞亚群、免疫标记物和核心调控因子，不仅为中国地方猪品种抗病抗逆优良特性的评价提供了科学的指导和依据，同时为猪免疫学相关研究提供理论和数据支持，有助于促进未来人类免疫和异种器官移植的生物医学研究。
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