摘要
细胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs）是由各类细胞分泌到体液中的脂质囊泡，它们通过将分子货物（蛋白质、核酸等）从原始细胞中运输到受体细胞内，在细胞间通讯过程中发挥重要作用。其中，肿瘤来源的循环外泌体（Exosomes）参与了肿瘤发生、转移、免疫逃逸等几乎所有的肿瘤生物学过程。同时，循环外泌体稳定性高，承载信息量丰富，被认为是液体活检的理想生物标志物。然而，循环外泌体在癌症早期表达量少，并容易被正常细胞分泌的外泌体所掩盖，因此，循环外泌体的分离、分析与检测一直面临着异质性强、早期含量低、背景干扰大、分离困难等技术难点。目前，循环外泌体的检测方法大多依赖超离分离及常用的表面标记物检测。超离法效率不高、特异性差、灵敏度低。表面标记物检测虽然提高了特异性，但纳米囊泡上标记蛋白的稀缺性给高效界面反应带来了巨大挑战。因此，设计具有高亲和力识别界面的微流控芯片，从而开发高效、特异的分离分析方法已迫在眉睫。 因此，本文在现有的微流控芯片中设计了一种流体纳米孔微界面（FluidporeFace），在该纳米多孔鱼骨微结构上修饰SLB，通过多尺度增强的分子相互作用，能够实现高效的界面反应。在微尺度上，鱼骨图案可以扰乱层流，增强质量效应，促进靶标从样本溶液中扩散到捕获界面上；在纳米尺度上，纳米微孔结构能有效降低液固界面的边界效应，从而促进目标与界面的接触；在分子尺度上，流动的磷脂双分子层可使识别分子靶向聚集，显著增强结合亲和力。在上述三个层面协同作用下，该微流控芯片成功对血浆样本中的循环外泌体实现超灵敏检测，对肿瘤的诊断和治疗具有十分重要的意义。本文主要工作如下： （1）本文采用胶体蒸发自组装的方法制备了三维纳米鱼骨芯片（F-3DHBChip），其内部是由直径1μm的硅球紧密堆砌而成的微孔鱼骨结构。然后在硅球上铺设一层流动的SLB，并修饰上带胆固醇末端的可特异性结合EpCAM蛋白的核酸适体。这种具有流动高亲和力界面及微结构的微流控芯片命名为F-3DHBChip。 （2）本文中分别培养了A375（人黑色素瘤细胞）、U251（人神经胶质瘤细胞），且进行蛋白定量、粒径检测、蛋白表达等分析。从细胞培养液中提取得到肿瘤来源外泌体，然后采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）对外泌体的形态和大小进行表征。随后，本文表征了不同组分比例所构成的界面，amp;nbsp;发现其流动性不同而导致扩散系数不同，从而进一步导致捕获性能的差异。最后，本文对实际肿瘤患者的外周血样，进行离心去除血细胞后得到血浆，进行F-3DHBChip芯片内实际样本的测定。结果成功完成对24例肿瘤患者样本的阳性检出，其PD-L1表达水平均显著高于10例健康供体。F-3DHBChip这种多尺度增强界面反应的策略能为新型生物传感器的设计及临床液体活检提供新思路。
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