摘要
脊髓损伤（SCI）导致损伤处大量轴突断裂，破坏上下行传导通路诱导机体功能障碍。在成年哺乳动物中，中枢神经系统损伤的轴突难以再生，这似乎是脊髓损伤患者难以完全康复的主要原因。因此，SCI的治疗重点是如何促进损伤的轴突再生。既往研究发现，轴突的内源性生长能力是再生的决定性因素之一，受体内与生长发育相关的通路调节。在成体神经元内敲除磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)基因能够激活mTOR通路，提高轴突内源性生长能力。还有研究发现，在敲除PTEN的基础上，同时敲除细胞因子信号抑制物3（SOCS3）基因，激活另一条生长调节通路JAK/STAT，能显著增强轴突再生的效果。因此，我们推测联合调控AKT/mTOR通路和JAK/STAT3通路活性是有效提高神经元内源性再生能力的治疗策略。 由于再生轴突沿着错误的方向延伸，不能与靶神经形成功能性突触；而且再生轴突往往缺乏髓鞘包裹，不能有效的进行信息传递。因此，很少有文献报道长距离的轴突再生能促进损伤的功能恢复。而运动训练是诱导再生轴突形成功能性突触的良好方式，能在一定程度上促进轴突髓鞘形成，有助于运动功能改善。所以，运动训练对功能恢复而言是至关重要的。因此，我们考虑通过RNA干扰技术调控PTEN和SOCS3的表达，探索激活mTOR和JAK/STAT信号通路并联合任务导向性训练对C5脊髓钳夹损伤后皮质脊髓束轴突再生和上肢功能恢复的影响。 方法： 1.颈5脊髓损伤模型制备：10只C57成年雌性小鼠随机分为正常对照组（NC,n=5）和颈5钳夹损伤组（C5Crush，n=5）。C5Crush组动物接受颈5钳夹损伤，而NC组动物仅打开椎板。损伤后2周，所有动物进行生物素化葡聚糖胺（BDA）注射用来顺行示踪皮质脊髓束，观察损伤处轴突断裂情况。BDA示踪14天后灌注取材，免疫荧光染色检验PKCγ蛋白表达情况以判断背侧皮质脊髓束损伤程度。 2.抑制PTEN和SOCS3基因表达促进脊髓损伤小鼠轴突再生的效果：40只成年C57小鼠随机分成PTEN/SOCS3组（n=10）、PTEN组（n=10）、SOCS3组(n=10)和Control组（n=10）。PTEN/SOCS3组在感觉运动皮质区域局部注射AAV9-PTEN-RNAi和AAV9-SOCS3-RNAi混合病毒以激活AKT/mTOR和JAK/STAT通路；PTEN组注射AAV9-PTEN-RNAi病毒，SOCS3组注射AAV9-SOCS3-RNAi以分别激活AKT/mTOR和JAK/STAT通路；对照组注射空载对照病毒。病毒注射14天所有动物接受颈5钳夹损伤，并在损伤后6个月，使用BDA顺行示踪皮质脊髓束，以观察损伤后背侧皮质脊髓束再生情况。示踪14天后灌注取材，免疫荧光观察病毒在皮质第V层锥体神经元的转染效果，锥体神经元mTOR和JAK/STAT信号的激活情况。 3.提高内源性再生能力联合任务导向性康复训练对脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的影响：选取同一批次的成年C57雌性小鼠进行4周的任务导向性运动预训练，从中筛选出40只表现良好的小鼠，随机分成PTEN/SOCS3+Ex组（n=10）、PTEN/SOCS3组（n=10）、Control+Ex组(n=10)和Control组（n=10），根据前期的训练结果，按照分组分别向优势侧感觉运动皮质区域局部注射AAV9-PTEN-RNAi和AAV9-SOCS3-RNAi混合病毒和空载对照病毒。病毒注射14天后所有动物接受颈5钳夹损伤。脊髓钳夹损伤后5天PTEN/SOCS3+Ex组和Control+Ex组所有动物进行为期4周的任务导向性训练，PTEN/SOCS3组和Control组动物待在相同场景中但不进行训练。伤后6周所有小鼠注射BDA顺行示踪皮质脊髓束用来观察损伤轴突再生情况。在损伤前、训练开始和结束时行单粒小丸抓取任务检测小鼠上肢抓取运动技巧改善情况；在损伤前、损伤后1周、2周、4周和6周行水平楼梯和圆筒攀爬探索测试检测小鼠精细运动功能恢复情况。损伤后8周进行灌注取材，免疫荧光观察皮质锥体神经元通路激活情况。 结果： 1.颈5钳夹动物损伤处观察大量轴突断裂、萎缩回撤；与对照组相比，损伤组动物胸段脊髓横切面上背侧皮质脊髓束走行区域PKCγ表达呈阴性。 2.病毒正确注入感觉运动皮质第V层，向周围扩散并成功转染锥体神经元；且AAV9-PTEN-RNAi和AAV9-SOCS3-RNAi能成功同时转染目标神经元。PTEN/SOCS3组和PTEN组p-S6表达水平明显高于SOCS3组和Control组（P＜0.01）；p-STAT3在PTEN/SOCS3组和SOCS3组中表达明显强于PTEN组和Control组（P＜0.01）。与Control组相比，PTEN/SOCS3组、PTEN组和SOCS3组出现明显的轴突再生反应（P＜0.05），在损伤尾侧，PTEN/SOCS3组表现处更多的再生轴突数量和更远的再生距离（P＜0.05）。 3.PTEN/SOCS3+Ex组、PTEN/SOCS3组和Control+Ex组锥体神经元内p-S6表达多于Control组（P＜0.01），其中PTEN/SOCS3+Ex组和PTEN/SOCS3组内的强度明显更高（P＜0.01）。PTEN/SOCS3+Ex组和PTEN/SOCS3组p-STAT表达水平比Control+Ex组和Control组高（P＜0.01）。PTEN/SOCS3+Ex组和PTEN/SOCS3组相较于Control+Ex组和Control组表现出明显的轴突再生（P＜0.05），其中PTEN/SOCS3+Ex组再生效果更好（P＜0.05）。与Control+Ex组相比，PTEN/SOCS3+Ex组在任务导向性训练中抓取表现更佳（P＜0.01）；训练完成后PTEN/SOCS3+Ex组和Control+Ex组的抓取功能好于PTEN/SOCS3组和Control组（P＜0.05）。损伤后6周，PTEN/SOCS3+Ex组上肢错误率低于Control组（P＜0.05），PTEN/SOCS3+Ex组损伤上肢使用率高于Control组（P＜0.05）。 结论： 1.颈5钳夹能完全且特异的损伤颈5节段背侧皮质脊髓束，适合作为研究再生的模型。 2.RNAi技术能有效的激活mTOR和JAK/STAT信号通路，提高轴突内源性生长能力从而促进脊髓损伤小鼠轴突再生。两条通路共同激活对再生能力提高效果更为明显，促进再生的作用更大。 3.提高内源性再生能力联合任务导向训练对损伤轴突有明显的再生促进作用，改善上肢功能障碍，诱导上肢运动功能恢复。
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