摘要
目的：耐药结核病(drug-resistanttuberculosis)尤其是耐多药结核(multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB)的出现是目前全球结核病控制所面临的最为严峻的挑战。耐药结核病病程长，治愈率低。这都增加了耐药结核分枝杆菌的传播机会。针对耐多药结核病，世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）推荐一种以氟喹诺酮以及二线注射药物为主要骨架的治疗方案，这种方案可以缩短治疗时间。因此，对病人体内结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)进行快速的氟喹诺酮药物敏感性测试，以确定病人是否适用这种疗法是非常必要的。据此我们建立一种基于PCR的CRISPR-Cas13a突变检测系统，该系统可对结核分枝杆菌氟喹诺酮药物耐受相关突变位点进行快速检测。 方法：利用Cas13a在crRNA导向下与目标序列之间的碱基错配会影响其附带切割活性的特点，设计出合适的crRNA，Cas13a可识别出靶标基因之间单个碱基的差异。结核分枝杆菌氟喹诺酮药物耐受相关突变主要为DNAGyrA特定位点(A90V,S91P,D94A,D94N/Y,D94G,D94H)，分子耐药机制清晰，容易实施crRNA引导下的Cas13aRNA切割活性的激活，从而可以区分出氟喹诺酮耐药产生的单碱基突变型结核杆菌菌株与野生型菌株。 结果：在本研究中最好的实验条件下，建立的PCR-CRISPR/Cas13a系统在检测结核杆菌氟喹诺酮耐药相关基因突变时有比较好的特异性和灵敏度。在95位氨基酸突变检测位点，该系统检测的灵敏度下限可达10copy/ul。27个结核杆菌氟喹诺酮耐药单碱基突变样品的检测结果和PCR-Sanger测序结果保持一致。 结论：本研究通过对某一种氨基酸单碱基突变位点筛选出最具特异性的crRNA，检测氟喹诺酮耐药的结核分枝杆菌，我们可以实现对常见的88，90，91，94，95位点氨基酸单碱基突变导致的结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药进行检测。该体系的成功建立证明了CRISPR-Cas13a系统检测SNP的可行性。
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