摘要
研究背景 缺血性心脏病常发生心肌缺血，再供血后损伤加重，称为心肌缺血再灌注(Ischemia/repermsion，I/R)损伤。心肌I/R已损伤多见于经皮冠脉介入术、心脏瓣膜手术和心内直视手术等治疗，造成心肌梗死、心律失常、心力衰竭和心肌细胞死亡等，严重影响患者的康复。近年来，围手术期心肌保护受到重点关注，因此探索防治心肌I/R损伤的机制，在临床麻醉中具有重要意义。 铁死亡(Ferroptosis)是心肌I/R损伤中细胞的重要死亡方式，阻抑心肌细胞铁死亡可以减少心肌I/R损伤。在脂氧合酶或Fe2+的作用下，脂质过氧化和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)增多导致细胞铁死亡。铁死亡的特征是线粒体萎缩、嵴减少和外膜破裂等。当心肌细胞受到缺血缺氧刺激时，P53的活性增强并进入细胞核调节下游蛋白的表达，促进铁死亡的发展。因此，如何抑制P53活性进而抑制心肌细胞铁死亡，成为减轻心肌I/R损伤的关键。 丙泊酚的结构与维生素E类似，具有较强的抗氧化作用。通过促进抗氧化酶的表达，丙泊酚抑制ROS产生和脂质过氧化，减轻心肌娘损伤。细胞ROS过度产生和脂质过氧化，是铁死亡发生的重要因素。因此，丙泊酚可能通过抑制心肌细胞铁死亡，发挥心肌保护作用。丙泊酚抑制心肌I/R损伤中P53的活性，但其机制尚不明确。P53活性受蛋白激酶B(ProteinkinaseB，PKB/AKT)的负调节，磷酸化的AKT促进鼠双微基因2(Murinedoubleminute2，MDM2)与P53结合，诱发P53分解从而抑制细胞铁死亡。已证实丙泊酚通过调控AKT/P53信号通路，抑制大鼠肝脏I/R损伤。丙泊酚是否通过抑制心肌细胞铁死亡，减轻心肌I/R损伤?AKT/P53信号通路是否在丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡中起作用?迄今未被研究。 本课题组提出假设:丙泊酚通过抑制心肌细胞铁死亡，减轻心肌I/R损伤，上述机制与AKT/P53信号通路有关，为验证该假说，本课题组设计了相关实验。 第一部分:丙泊酚通过抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌缺血再灌注损伤 研究目的 1.观测细胞铁死亡在丙泊酚减轻H9C2细胞损伤的作用。 2.探讨细胞铁死亡在丙泊酚减轻大鼠心肌I/R损伤中的作用。 研究方法 1.H9C2细胞常规培养和传代。 2.细胞分组，用过氧化氢(H2O2)和伊拉斯汀(Erastin，铁死亡诱导剂)建模(图1-1A): (1)C组:常规培养25h。 (2)H组:常规培养60min，加入200μMH2O2刺激24h。 (3)H+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和200μMH2O2刺激24h。 (4)E组:常规培养60min，加入2.5μMErastin刺激24h。 (5)E+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和2.5μMErastin刺激24h。 3.使用相差显微镜观察、台盼蓝染色和CCK-8实验，检测细胞活力(图1-2)。 4.通过流式细胞术和荧光染色，检测细胞ROS含量。 5.使用免疫荧光，评估细胞核因子E2相关因子2(Nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2，NRF2)核转位水平。 6.通过试剂盒检测细胞丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)活性和亚铁含量。 7.建立大鼠离体心脏Langendorff模型，分组(图1-1B): (1)C组:灌注KH溶液120min。 (2)I/R组:灌注KH溶液30min，停止灌注30min和再灌注60min。 (3)I/R+P组:灌注KH溶液10min和50μM丙泊酚20min，停止灌注和再灌注。 8.通过试剂盒测定心肌乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)、SOD活性、肌酸激酶同工酶(Creatinekinaseisoenzymes，CK-MB)的含量、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(Reducedglutatllione/oxidizedglutathione，GSH/GSSG)比值、MDA和亚铁含量(图1-3)。 9肢用氯化三苯基四氮唑(Triphenyltetrazoliumchloride，TTC)、HE染色和透视电镜评估心肌梗死面积、病理和线粒体情况。 10.采用免疫组化测定心肌NRF2核转位情况。 11.通过Westernblot评估H9C2细胞和心肌NRF2、血红素氧合酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)、铁蛋白重链(Ferritinheavychain1，FTH1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathioneperoxidase4，GPX4)和胱氨酸/谷氨酸反向转运体(Cystine/glutamatereversetransportbody，XCT)表达。 结果 1.与对照组相比，H2O2导致细胞活力降低和活性氧增多;丙泊酚使用后，细胞活力和活性氧较H组回落。 2.H2O2引起NRF2核转位和HO-1表达较对照组轻度增多;丙泊酚应用后，NRF2核转位和HO-1较H组显著增多。 3.与对照组比较，Erastin引起细胞活力降低和超氧阴离子增多;丙泊酚预处理后，细胞活力和超氧阴离子较E组缓解。 4.与对照组相比，Erastin导致MDA和亚铁含量增多，SOD活力和抗铁死亡酶表达降低;丙泊酚应用后，MDA、亚铁含量、SOD活力和抗铁死亡酶均回落。 5.与正常心肌比较，I/R引起LDH、CK-MB、MDA和亚铁含量增多，SOD活力和GSH/GSSG比值降低;与I/R组比较，丙泊酚治疗后LDH、CK-MB、MDA和亚铁含量降低，SOD活力和GSH/GSSG比值增多。 6.I/R诱导较正常心肌梗死面积增加、纤维水肿和线粒体嵴扭曲;与I/R组相比，丙泊酚治疗后心肌梗死面积减少、纤维水肿减轻和线粒体嵴规整。 7.I/R处理后，NRF2核转位和HO-1较正常心肌轻度增加;丙泊酚预处理后NRF2核转位和HO-1较I/R组显著增加。 8.与正常心肌比较，I/R引起抗铁死亡酶表达减少;丙泊酚使用后，抗铁死亡酶表达较I/R组显著增加。 结论 1.丙泊酚抑制H9C2细胞铁死亡。 2.丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌I/R损伤。 第二部分:丙泊酚调控AKT/P53通路抑制铁死亡减轻心肌缺血再灌注损伤 研究目的 1.探讨丙泊酚对AKT基因敲除的H9C2细胞铁死亡的影响。 2.探究丙泊酚是否通过调控AKT/P53信号通路、抑制心肌细胞铁死亡以减轻心肌I/R损伤。 研究方法 1.H9C2细胞常规培养和传代。 2.细胞分组(图2-1A): (1)C组:常规培养25h。 (2)E组:常规培养60min，加入2.5μMErastin刺激24h。 (3)E+P组:加入50μM丙泊酚刺激60min和2.5μMErastin刺激24h。 3.使用相差显微镜观察、台盼蓝染色和CCK-8实验，检测细胞活力(图2-2)。 4.通过Westernblot和CCK-8实验，评估丙泊酚对于AKTsiRNA和Erastin处理的H9C2细胞，AKT、P-AKT、抗铁死亡酶(FTH1、GPX4、XCT)和细胞活力的影响。 5.建立大鼠离体心脏Langendorff模型，使用AKT抑制剂MK2206，分组(图2-1B): (1)C组:灌注KH溶液120min。 (2)I/R组:灌注KH溶液30min，停止灌注30min和再灌注60min。 (3)I/R+P组:灌注KH溶液10min和50μM丙泊酚20min，停止灌注和再灌注。 (4)I/R+P+MK:灌注15nMMK220610min和50μM丙泊酚20min，停止灌注和再灌注。 (5)I/R+MK:灌注15nMMK220610min和KH溶液20min，停止灌注和再灌注。 6.通过试剂盒检测心肌GSH/GSSG比值和亚铁含量(图2-3)。 7.使用HE染色和透视电镜测定心肌病理和线粒体情况。 8.通过Westernblot测定心肌抗铁死亡酶和P53表达。 9.使用Westernblot和免疫荧光评估心肌AKT和P-AKT表达。 结果 1.与ScramblesiRNA组比较，AKTsiRNA组AKT、P-AKT及抗铁死亡酶的表达和细胞活力降低;与ScramblesiRNAE组相比，AKTsiRNAE组抗铁死亡酶表达和细胞活力轻度降低;与ScramblesiRNAE+P组相比，AKTsiRNAE+P组抗铁死亡酶表达和细胞活力轻度降低。 2.I/R处理与对照相比，GSH/GSSG比值降低和亚铁含量增多;与I/R组和I/R+MK组比较，丙泊酚预处理分别提高GSH/GSSG比值和降低亚铁含量。 3.与对照组相比，I/R组引起心肌纤维水肿、波浪状改变和线粒体嵴扭曲;与I/R组和I/R+MK组相比，丙泊酚处理分别减轻心肌纤维水肿和波浪状变化、促进线粒体嵴规整。 4.I/R处理与对照组相比，抗铁死亡酶表达增多和P53表达降低;与I/R组和I/R+MK组比较，丙泊酚处理分别增加抗铁死亡酶表达和降低P53表达。 5.与对照组比较，I/R组P-AKT表达降低;与I/R组和I/R+MK组比较，丙泊酚处理均促进P-AKT的表达;各组AKT表达没有差异。 结论 1.丙泊酚影响AKT信号通路抑制H9C2细胞铁死亡。 2.丙泊酚调控AKT/P53信号通路抑制心肌细胞铁死亡，减轻心肌I/R损伤。 全文结论 丙泊酚调控AKT/P53通路抑制铁死亡减轻心肌I/R损伤。 创新性和意义 1.首次发现丙泊酚抑制心肌细胞铁死亡。 2.首次发现丙泊酚调控AKT/P53信号通路抑制心肌细胞铁死亡，减轻心肌I/R损伤。 局限性 1.未探讨丙泊酚心肌保护效应的浓度依赖性变化。 2.未检测其他抗铁死亡酶的表达。
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