摘要
本课题以甘草中活性成分甘草次酸为目标，基于基因组数据库挖掘出一种未见报道的葡萄糖醛酸酶（伯氏曲霉KAE8374379.1），使用MOFs和磁交联酶聚集体的方式固定葡萄糖醛酸酶，对其稳定性、重用性和副产物耐受性进行了研究。 1.基于NCBI数据库，通过同源序列比对筛选出两种分别来自伯氏曲霉(KAE8374379.1)和假单胞菌(KFY40603.1)的葡萄糖醛酸酶。构建了pET28a-AbGUS以及pET28a-KFY表达载体。对其催化活性、水解模式和水解产物进行了探究。发现伯氏曲霉中葡萄糖醛酸酶(AbGUS)对甘草酸有高水解活性，甘草酸转化率高达91.4%。通过质谱对产物进行了验证，发现水解过程酶专一性强，基本不生成单葡萄糖醛酸甘草次酸。 2.为了解决游离酶在反应过程中稳定性差且无法重复使用的问题，我们制备了一种磁响应锆基MOFs特异性载体(Fe3O4@UiO66)，巧妙的将葡萄糖醛酸酶纯化和固定化有机整合。Fe3O4@UiO66具有良好的磁响应、规则的形状和高特异性。固定后的β-葡萄糖醛酸酶表现出更广泛的pH适应性、温度稳定性和储存稳定性。Fe3O4@UiO66@AbGUS经过8次重用后仍保持80%的相对活性。更重要的是，创新性的发现了磁性纳米粒子可以使用二硫苏糖醇进行再生。经过简单处理后，再生的MOFs在前3次仍有90%以上的相对固载率。另外，发现了固定后酶对于副产物葡萄糖醛酸的耐受性明显增强。 3.通过引入表面羧基修饰的Fe3O4成功构建了磁交联酶聚集体(MCLEAs)。在使用戊二醛进行交联之前，碳化酰亚胺被用来增强葡萄糖醛酸酶与羧基功能化Fe3O4之间的相互作用，显著增强了固定化酶的酶活回收。与游离酶相比，MCLEAs具有更高的酸碱和热稳定性，6次循环后仍保留了63.3%的催化活性。更重要的是，我们同样发现了MCLEAs的副产物耐受性的提高，在10mM葡萄糖醛酸体系中催化活性是游离酶的221.5%。拉曼光谱结果显示，固定后β-葡萄糖醛酸酶的有序结构从43.9%增加到50.6%，存在更多的氢键，从而导致酶刚性的增强，解释了稳定性和耐受性的增加。
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