摘要
铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）是一种典型的革兰氏阴性条件致病菌，由于多重毒力和耐药性的存在使得每年临床感染治疗的成本非常高。磷酸化修饰是最常见的翻译后修饰机制，在调节蛋白质功能和细胞信号转导中起着重要作用。研究表明，细菌Ser/Thr蛋白激酶磷酸化可以参与细菌毒性和耐药性的调节，stk1编码铜绿假单胞菌的Ser/Thr蛋白激酶，但其磷酸化修饰在发病机制和耐药机制中的作用尚不清楚。 本研究采用基于TMT标记的液相色谱质谱联用的定量蛋白质组学策略，分析了野生菌株PAO1和敲除菌株Δstk1的蛋白表达变化，其中发现T6SS相关表达蛋白统一呈上调趋势，并从mRNA水平上证实了组学结果。T6SS是在铜绿假单胞菌中发现的分泌系统之一，参与病原菌的致病感染与耐药过程，其活性可通过磷酸化修饰进行调节。因此我们提出假设：铜绿假单胞菌Ser/Thr蛋白激酶Stk1磷酸化修饰调控T6SS分泌系统中相关蛋白的表达进而调控铜绿假单胞菌的毒力及耐药性。首先在Δstk1敲除菌的基础上构建了基因回补菌株Δstk1:stk1及敲除菌株ΔppkA-Δstk1、ΔppkA-Δstk1-Δpa1782，从绿脓菌素分泌、生物被膜生成、抗生素敏感性、生长竞争实验、摄取铁离子能力、运动性能力等T6SS介导的毒力与耐药方面，比较敲除菌，回补菌与野生菌株的差异。结果表明Stk1的缺失可导致绿脓菌素分泌减弱，被膜形成能力增强，对β-内酰胺酶类及头孢类抗生素的耐药性提高，提供生长竞争优势，并且增强对Fe3+离子的摄取，初步表明Stk1激酶磷酸化修饰参与T6SS介导的功能，且部分蛋白质组学结果与表型变化相一致。 为进一步确定Stk1调控机制，发现T6SS中的IcmF样蛋白含有Stk1可识别的磷酸化基序S553A554R555，而IcmF是一种新型的毒力因子调节剂，参与细菌运动、被膜形成、毒素分泌等生理功能，猜测IcmF是Stk1的潜在底物。为了深入揭示Stk1的调控机制，构建pET28a(+)-icmF-RD以及pET28a(+)-icmFS553A-RD融合表达载体，利用原核表达系统及亲和层析纯化得到Stk1、IcmF和IcmFS553A蛋白，进行体外磷酸化修饰反应，结果显示Stk1可磷酸化IcmF。另外构建SAR基序敲除菌株ΔicmF，比较分析野生菌株PAO1，stk1敲除菌株（Δstk1），Δstk1的回补菌株（Δstk1:stk1）和磷酸化基序敲除菌株（ΔicmF）的生物被膜合成差异及金属离子吸收能力。结果显示Δstk1和ΔicmF共同促进生物被膜的合成，减弱对Fe3+的吸收，证实Stk1激酶通过磷酸化修饰IcmF进而调控铜绿假单胞菌的生理功能。 总之，本研究初步揭示Stk1激酶磷酸化修饰IcmF介导T6SS调控铜绿假单胞菌的毒力及耐药，同时采用蛋白质组学策略，为深入研究Stk1的磷酸化网络调控机制以及铜绿假单胞菌的致病机理提供了数据支持，为基于磷酸化调控的新型抗生素药物及疫苗的开发和研究提供了理论基础和创新思路。
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