摘要
目的： 华法林(Warfarin)是最具代表性的香豆素类抗凝药物之一，因其具有充足的循证医学证据、确切的疗效以及低廉的价格，被广泛应用于临床抗凝治疗中。然而，华法林治疗的药理学难点在于其狭窄的安全剂量范围以及显著的个体间剂量差异，将维生素K环氧化物还原酶复合物1(VitaminKepoxidereductasecomplex1,VKORC1)基因、细胞色素P4502C9(CytochromeP450,family2,subfamilyC,polypeptide9,CYP2C9)基因多态性与临床因素相结合来构建精准化剂量预测模型是华法林个体化治疗领域的研究热点。VKORC1作为华法林的作用靶点包含163个氨基酸，由VKORC1基因编码，是维持机体维生素K循环及凝血因子活化的限速酶。华法林作为维生素K类似物通过竞争性与VKORC1结合来抑制凝血因子的活化以达到抗凝血的目的。CYP2C9是一种重要的药物代谢酶，临床上使用的华法林是消旋体混合物。其中，S-华法林是主要有效成分，其抗凝活性是R-华法林的3～5倍，主要经CYP2C9催化代谢。因此，VKORC1基因多态性影响的是华法林与作用靶点的结合情况，而CYP2C9基因多态性影响的是华法林的代谢速率，这两种基因也被认为是最重要的可显著影响华法林用药剂量的遗传因素。与此同时，在结合患者年龄、性别、体重等非遗传因素后，研究人员建立了很多基于药物基因组学的华法林剂量预测模型。 然而这些模型在对不同种族人群进行华法林剂量预测时，其预测准确性会发生较大的变化，究其原因是因为不同种族间基因异质性的存在导致了种族特异性模型外推至其他种族时出现了模型预测准确性降低的问题，因此针对特定人群开发本土化的剂量预测模型是十分必要的。除此之外，VKORC1基因型对华法林剂量的影响远高于其它因素，华法林与靶蛋白VKORC1相互作用的复杂性表现在VKORC1基因发生某些单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)突变后会导致患者产生部分或完全的华法林药物抵抗，这些患者的混杂存在严重影响了基于回归分析的华法林剂量预测模型的预测准确性。然而，这些与VKORC1基因SNP突变相关的华法林药物抵抗问题仅在个别的病例报告或较短的临床观察研究中有所报道，其具体的作用机制仍有待进一步阐明。 因此，为了针对山西地区患者构建华法林精准化用药模型，同时探索VKORC1基因SNP突变与华法林药物抵抗的关系，本研究首先利用山西地区华法林用药患者的临床数据(n=217)对六种国内外主要华法林剂量预测模型进行预测准确性评价，考察各因素对华法林剂量的影响权重，为寻找和建立更加适合山西地区患者的华法林剂量预测模型提供理论依据；其次，为了进一步提高自建模型的预测准确性，寻找更为贴合的建模平衡点以便优化模型，本研究针对因变量“华法林最佳剂量”(Warfarinoptimaldose,WOD)进行数据变换后再次进行单因素及多元线性回归分析，并使用验证集数据对各构建模型进行预测准确性验证；第三筛选山西地区患者(n=124)VKORC1基因外显子区可导致VKORC1氨基酸序列发生改变的SNP突变，随后通过分子对接技术(MolecularDocking,MD)模拟华法林与突变前后VKORC1结合情况的改变，寻找结合能降低的突变型；第四利用FIX(F9)-VKORC1基因共表达转染体系构建基于HEK293T细胞培养的可表征VKORC1与华法林结合情况的分析模型，以此来避免使用非生理性还原剂二硫-苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)驱动实验考查华法林对VKORC1活性的抑制。选择F9与VKORC1基因共同转染的原因一方面是由于F9因子的活化必须依赖于维生素K循环，而维生素K循环的限速酶是VKORC1，使用不同浓度华法林干预时其与VKORC1结合强弱会改变F9因子的活化速率，因此通过考察F9因子活性可间接表征华法林与VKORC1的结合情况；另一方面是HEK293T细胞中F9因子表达量中等偏低，通过构建过表达质粒可保证细胞中F9因子表达相对过量，能够更加准确的考察F9因子活化速率的变化情况；第五为了验证MD模拟结果的正确性，通过构建突变型F9-VKORC1基因共表达转染系统，利用已建立的可表征VKORC1与华法林结合情况的细胞分析模型，在细胞水平上考察VKORC1基因分别发生相应SNP突变后华法林与其表达的突变型VKORC1结合情况的改变，从而探索华法林药物抵抗与VKORC1基因外显子区SNP突变的关系，为阐明华法林药物抵抗的机制提供研究基础。 方法： 1、六种主要华法林剂量预测模型对山西地区患者的预测性能评价 以2017年1月-2019年12月期间在山西某大型综合三甲医院接受华法林抗凝治疗的患者作为研究对象，经排除标准筛选及知情同意后共有217名患者纳入研究。针对每位患者分别进行VKORC1(rs9923231)、CYP2C9*2(rs1799853)以及CYP2C9*3(rs1057910)基因分型检测。此外，同时收集患者年龄（岁）、性别、体重(kg)、身高(cm)、合并用药等其它15种非遗传因素资料。WOD定义为患者在住院期间或随访期间使INR保持在目标范围内的华法林用药剂量。六种主要华法林剂量预测模型的筛选原则如下：①模型是用来计算华法林维持剂量的，而不是估算初始剂量；②模型选择的最小可接受研究对象数量大于或等于120例；③纳入日本、韩国学者专为亚洲人口建立的模型。最终来自不同参考文献的六种主要华法林剂量预测模型被纳入本研究。其中两种模型(HUANG和MIAO)来源于中国，IWPC为国际公认的模型，OHNO和KIM分别为日本学者和韩国学者建立的模型，BRESS模型为针对非洲裔美国人建立的模型。 分别使用六种华法林剂量预测模型对217名患者进行剂量估算，每位患者得到六个预测剂量(Predicteddose,PD)，使用配对样本t-检验(Pairedsamplet-test)和皮尔逊相关系数(Pearson''scorrelationcoefficient)来评估六组预测剂量PD与WOD之间的统计学差异并对各模型预测准确性进行排序；此外，根据预测值PD与WOD值计算的平均绝对误差(Meanabsoluteerror,MAE;=N1∑ni|PDo-W0Di)也用于评价六种模型的预测准确性；剂量分层分析中，根据日剂量将患者分为3个剂量组，即低剂量组(≤3mg/day)、中剂量组(3–5mg/day)和高剂量组(gt;5mg/day)，通过计算平均相对误差(Meanrelativeerror,MRE;MRE=1n∑ni=1|PDi-W0Di|W0Di)来评估每种模型对不同剂量组的预测准确性；最后采用单因素分析考察各临床因素对华法林剂量的影响，其中二分类变量采用独立样本t-检验(Independentsamplet-test)进行变量间统计学差异分析，多分类变量则采用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验变量间的统计学差异。 2、基于VKORC1基因多态性的山西地区患者华法林剂量预测模型构建 为了更加准确的拟合各影响因素对WOD的线性回归方程，提高模型的预测准确性，针对因变量WOD进行三种形式的数据转换。本研究以上述217名患者作为研究对象，将患者的WOD进行取对数(lgWOD)，倒数(1/WOD)以及开方(√W0D)数据变换，之后以WOD及其三种变换值作为因变量再次分别进行单因素分析，其中二分类变量采用独立样本t检验进行变量间统计学差异分析，多分类变量则采用单因素方差分析检验变量间的统计学差异。针对上述经单因素分析筛选出的Plt;0.05的影响因素进行多元线性回归分析，采用逐步回归法筛选变量(αin=0.10,αout=0.15)，最终得到4个回归方程，选择R2值较高的两个回归方程作为备选的山西地区患者华法林剂量预测模型。 以2020年1月-2020年6月期间在山西某大型综合三甲医院接受华法林抗凝治疗患者(n=24)的临床数据组成验证集，分别使用上述两个备选的山西地区患者华法林剂量预测模型与已发表模型（第一部分筛选出的最优模型）来估算华法林PD值。每位患者将得到3个PD值，使用配对样本t检验和Pearson相关分析来评估三组预测剂量PD与WOD之间的统计学差异并对各模型预测准确性进行排序；此外，根据预测值PD与WOD值计算的MAE(MAE=1n∑ni=1|PDi-W0Di|)也用于评价上述三种模型的预测准确性；确定最优模型后，针对模型中的各影响因素进行权重分析，对比各因素对华法林剂量的影响程度。 3、山西地区患者VKORC1基因外显子区SNP筛查及VKORC1与R/S-华法林相互作用模拟研究 采用高通量基因测序技术对124名服用华法林的患者进行VKORC1基因外显子区测序，筛选出可导致VKORC1氨基酸序列发生改变的有意义SNP突变。随后将突变前后的VKORC1氨基酸序列导入Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)数据库，构建VKORC1基因突变前后的蛋白模型。使用Desmond(Schr?dingerRelease2021-1)软件对突变前后蛋白模型进行20ns分子对接(MolecularDocking,MD)模拟。采用TIP3P显式溶剂模型，将蛋白模型放入溶剂盒子中，盒子边界距离蛋白边界至少10?。此外，体系中加入0.15nM的NaCl以模拟生理条件。体系的优化采用OPLS-3e力场进行能量最小化。选择1ps的记录时间间隔，从而得到具有2000个独特构象的MD轨迹。使用等温等压(NPT)系综时，温度固定在300K，压力为1.01bar。积分时间步长设置为2fs。 使用PyRx-v0.8虚拟筛选工具与AutoDock-Vina相结合进行MD模拟研究。所有的分子都经过PyRx软件包中的openbabel进行能量最小化后转换成PDBQT格式。所有配体对接到活性口袋所在方形盒子中(center_x=-9.7,center_y=26.6,center_z=56.6,size_x=17.5,size_y=15.3,size_z=18.3)。对接盒子的选择允许配体在网格框中的指定值内自由移动。拉马克遗传算法(LamarckianGeneticAlgorithm,LGA)中配体的状态变量，包括初始位置、方向和扭转都是随机设置的。每个配体设置8次对接，结果根据均方根偏差(RMSD)标准进行聚类分析。通过以上MD模拟研究，进一步推测可导致华法林产生耐药抵抗的VKORC1基因SNP突变位点。 4、可表征靶蛋白VKORC1功能的HEK293T细胞分析模型构建 以FIX(F9)活性作为华法林与VKORC1结合的表征，使用共表达人类F9和VKORC1基因的质粒载体对HEK293T细胞进行转染，使两种蛋白在细胞中过表达。转染后通过荧光显微镜、实时荧光定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,RT-qPCR)以及蛋白质免疫印迹(Westernblot,WB)来评估转染效果，考察F9与VKORC1mRNA、蛋白的过表达情况。随后，分别在使用空载质粒(F9-VKORC1zero,FVZ)和过表达质粒(F9-VKORC1,FV)转染24h的细胞培养液中添加维生素K(5μg/mL)以及不同浓度的华法林(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μΜ)进行干预，继续培养48h后检测细胞培养液中F9因子的相对活性（以未添加华法林的细胞培养孔中F9因子活性为分母）。考察F9因子相对活性与华法林干预浓度的浓度依赖性，评价基于HEK293T细胞培养的F9-VKORC1共表达质粒载体系统中使用F9因子的相对活性来表征华法林与VKORC1结合情况的科学性。 5、VKORC1基因外显子区SNP突变与华法林药物抵抗的机制研究 根据筛选出的VKORC1外显子区SNP突变，利用点突变技术构建突变型F9-VKORC1质粒载体，得到可在HEK293T细胞中表达相应突变型VKORC1的共表达质粒载体。分别使用FVz以及突变型F9-VKORC1质粒载体转染细胞，转染后通过荧光显微镜、RT-qPCR以及WB来评估转染效果，考察F9与VKORC1mRNA、蛋白的过表达情况。转染24h后在细胞培养液中添加维生素K(5μg/mL)以及不同浓度的华法林(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μΜ)进行干预，继续培养48h后检测细胞培养液中F9因子的相对活性，在细胞水平上考察华法林与野生型及突变型VKORC1的结合情况，从而探索华法林药物抵抗与VKORC1基因外显子区SNP突变的关系。 结果： 1、六种主要华法林剂量预测模型对山西地区患者的预测性能评价 (1)六种剂量预测模型的预测准确性：配对样本t检验结果显示，OHNO（日本学者构建）和IWPC（国际华法林药物基因组学学会）模型与WOD不存在显著性差异。随后，在采用Pearson相关性分析以及MAE进行进一步分析时，其结果均显示针对山西地区患者OHNO模型的预测准确性略优于IWPC模型(WOD-IWPC,r=0.606;WOD-OHNO,r=0.636)，为预测准确性较高的模型。 (2)六种剂量预测模型对华法林低、中、高剂量组的预测性能比较：剂量分层分析结果显示，对于低剂量组患者（≤3mg/d，占总人数的56.2%），HUANG模型提供了更好的剂量预测准确性；对中剂量组患者（3–5mg/day，占总人数的35%），OHNO模型是最优选择；对于高剂量组患者（gt;5mg/d占总人数的8.8%），KIM模型展现出了最好的预测性能。 (3)遗传及临床因素对华法林剂量的影响：单因素分析结果显示，VKORC1基因型、是否合并房颤、是否合并心力衰竭/心肌病状态、CYP2C9基因型、BMI、性别以及是否存在血清白蛋白低下等7个因素能显著影响WOD(Plt;0.05)，因此临床医生在使用华法林进行抗凝治疗时应特别关注以上因素。 2、基于VKORC1基因多态性的山西地区患者华法林剂量预测模型构建 (1)以WOD及其三种变换值为因变量的单因素以及多元线性回归分析：分别以WOD、lgWOD、1/WOD和√W0D为因变量的单因素以及多元线性回归分析结果显示，最终进入四个回归方程的因素有：VKORC1基因型、体重(kg)/体重指数、CYP2C9基因型、并发房颤（有/无）和性别，上述四个线性回归方程的R2分别为0.440、0.412、0.286以及0.448。取R2较高的两个回归方程作为备选自建模型，自建模型1：WOD=2.006+1.597X1-0.613X2-0.711X3+0.055X4-0.356X5，R2=0.440，其中X1代表VKORC1基因型、X2代表合并房颤、X3代表CYP2C9基因型、X4代表体重指数、X5代表性别；自建模型2：√WOD=1.265+0.408X1+0.007X2-0.166X3-0.237X4，R2=0.448，其中X1代表VKORC1基因型，X2代表体重，X3代表合并房颤，X4代表CYP2C9基因型；当VKORC1基因型为AA、AG和GG时赋值分别为0、1、2；当CYP2C9基因型为*1/*1、*1/*3和*3/*3时赋值分别为0、1、2；合并房颤时赋值为1，否则赋值为0；性别为女时赋值为1，否则赋值为0；体重为患者实际体重，单位为(kg)；体重指数为实际计算值。 (2)自建模型1、自建模型2和OHNO模型对华法林剂量预测准确性评估：使用验证集数据（由24名山西地区华法林用药患者组成）对自建模型1、自建模型2和OHNO模型进行预测准确性评价，配对样本t检验结果表明，自建模型1、自建模型2和OHNO模型的PD与WOD无显著性差异。随后Pearson相关性分析及MAE分析结果均显示上述三种模型预测准确性排序为：自建模型2gt;自建模型1gt;OHNO。 (3)自建华法林剂量预测模型中各影响因素权重分布：自建华法林剂量预测模型2中，VKORC1基因型、体重、合并房颤、CYP2C9基因型进入线性回归方程，上述四种因素可解释44.8%的WOD个体间差异，其中VKORC1基因型权重最大为29.7%。与此同时，将217例患者数据中√W0D异常高的3个点剔除后重新进行回归分析，结果显示进入回归方程的因素仍为上述四种因素，但它们可解释WOD个体间差异的权重提高到了52.3%。 3、山西地区患者VKORC1基因外显子区SNP筛查及VKORC1与R/S-华法林相互作用模拟研究 (1)VKORC1基因测序结果及氨基酸序列分析：124例患者VKORC1基因的高通量测序结果表明，有3位患者存在VKORC1基因外显子区SNP突变，突变均位于2号外显子区，位置及类型分别是：chr:16:31093398(197Tgt;A)和chr:16:31093392(203Agt;G)。根据EditSeq(Version7.1.0)及DNAMAN(Version8.0)软件比对分析可知，chr:16:31093398(197Tgt;A)突变将引起VKORC1第66位氨基酸由缬氨酸(Valine,V)变为谷氨酸(Glutamicacid,E)；chr:16:31093392(203Agt;G)突变将引起VKORC1第68位氨基酸由组氨酸(Histidine,H)变为精氨酸(Arginine,R)。 (2)华法林与VKORC1的分子对接模拟结果：MD研究结果显示，VKORC1野生型(Wildtype,WT)和66位突变体(V66E)与(R/S-)华法林的结合能相同，而68位突变体(H68R)与WT相比，其结合能降低，R-华法林和S-华法林与H68R的结合能分别是-8kcal/mol和-8.3kcal/mol。此外，68位突变(H68R)导致原有的氨基酸互作关系发生变化，说明68位氨基酸由组氨酸(H)突变为精氨酸(R)后，会导致(R/S-)华法林与VKORC1的结合能力下降。 4、表征靶蛋白VKORC1功能的HEK293T细胞分析模型构建 (1)FVZ、FV转染HEK293T细胞效果及F9与VKORC1mRNA、蛋白的过表达：使用FVZ、FV质粒分别转染HEK293T细胞24h后，置于荧光显微镜下可明显看到细胞中存在绿色荧光；RT-qPCR实验结果表明FV转染HEK293T细胞48h后，与空载质粒FVZ组相比，F9mRNA表达平均增加115.33倍(379.45±165.85/3.29±1.70)；VKORC1mRNA表达平均增加12.91倍(11.36±2.95/0.88±0.09)，与FVZ对照组相比，F9与VKORC1mRNA的表达均存在显著性差异(Plt;0.05)；Westernblot实验结果表明：FV转染HEK293T细胞48h后，与空载质粒FVZ组相比，F9蛋白平均过表达13.16±2.23倍，VKORC1蛋白平均过表达1.46±0.20倍，与FVZ对照组相比，F9与VKORC1蛋白的过表达均存在显著性差异(Plt;0.05)。 (2)FVz、FV转染后HEK293T细胞上清液F9因子含量水平：FVZ转染组、FV转染组细胞分别经不同浓度华法林(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μΜ)干预后，各组内6孔培养皿上清液中F9的含量不会随着华法林浓度的增加而发生变化，各孔F9因子含量均无显著性差异(Pgt;0.05)；而FV转染组与FVz转染组相比，其各孔细胞上清液中F9的含量均明显高于FVz组，差异具有显著性(Plt;0.05)，表明构建的F9-VKORC1共表达质粒载体成功在细胞中过表达F9因子。 (3)FVz、FV转染后HEK293T细胞上清液F9因子相对活性：对经FVZ、FV转染72h后的HEK293T细胞的上清液进行F9因子相对活性检测，检测结果表明FVZ与FV转染组随着华法林浓度的增加，F9因子相对活性均下降，然而FV转染组随着华法林干预浓度的增加F9因子相对活性下降趋势要小于FVZ转染组。 5、VKORC1基因外显子区SNP突变与华法林药物抵抗的机制研究 (1)突变型F9-VKORC1共表达质粒载体构建与测序分析：利用点突变诱导技术将FV质粒上8850位的T碱基突变为A碱基可得到FV-M1（质粒上VKORC1基因发生chr:16:31093398,197Tgt;A突变）；将FV质粒上8856位的A碱基突变为G碱基可得到FV-M2（质粒上VKORC1基因对应chr:16:31093392,203Agt;G突变）。随后对上述三种质粒菌液进行测序，使用SnapeGene(Version5.2.3)软件对FVZ、FV-M1和FV-M2三种质粒的基因序列进行比对分析，结果显示FV-M1、FV-M2质粒成功按预定设计发生点突变，突变后表达的VKORC1分别对应第66位氨基酸突变(V66E)及68位氨基酸突变(H68R)。 (2)FV-M1/M2转染HEK293T细胞效果及F9与VKORC1mRNA、蛋白的过表达：使用FVZ、FV-M1和FV-M2质粒分别转染HEK293T细胞24h后，置于荧光显微镜下可明显看到细胞中存在绿色荧光；RT-qPCR实验结果表明FV-M1转染HEK293T细胞48h后，与空载质粒FVZ组相比，F9mRNA表达平均增加124.25倍(168.98±18.65/1.36±0.28)；VKORC1mRNA表达平均增加27.82倍(43.40±4.11/1.56±0.39)，与FVZ对照组相比F9与VKORC1mRNA的表达均存在显著性差异(Plt;0.05)；FV-M2转染HEK293T细胞48h后，与空载质粒FVZ组相比，F9mRNA表达平均增加255.64倍(166.17±17.32/0.65±0.33)；VKORC1mRNA表达平均增加10.83倍(12.78±2.02/1.18±0.33)，F9与VKORC1mRNA的表达均存在显著性差异(Plt;0.05)；Westernblot实验结果表明：FV-M1、FV-M2转染HEK293T细胞48h后，与FVZ对照组相比，F9与VKORC1蛋白的过表达均有显著性差异(Plt;0.05)。与FVZ组相比，FV-M1转染HEK293T细胞48h后，F9蛋白平均过表达4.48±1.08倍，VKORC1蛋白平均过表达1.54±0.20倍；FV-M2转染HEK293T细胞48h后，F9蛋白平均过表达5.06±0.27倍，VKORC1蛋白平均过表达1.74±0.25倍。 (3)FV-M1/M2转染后HEK293T细胞上清液F9因子含量水平：对经FVZ、FV-M1、FV-M2转染72h后的HEK293T细胞的细胞上清液进行F9因子含量水平检测，检测结果表明：FVZ转染组、FV-M1转染组以及FV-M2转染组细胞分别经不同浓度华法林干预后(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1μΜ)，各组内6孔培养皿上清液中F9的含量水不会随着华法林浓度的增加而发生变化，各孔F9因子含量均无显著性差异(Pgt;0.05)；而FV-M1、FV-M2转染组与FVz转染组相比，其各孔细胞上清液中F9的含量均显著高于FVz转染组，差异具有显著性(Plt;0.05)，表明构建的两种突变型F9-VKORC1共表达质粒载体FV-M1、FV-M2成功在细胞中过表达F9因子。 (4)FV-M1/M2转染后HEK293T细胞上清液F9因子相对活性：对经FVZ、FV-M1和FV-M2转染72h后的HEK293T细胞的细胞上清液进行F9因子相对活性检测，结果表明FVZ、FV-M1和FV-M2转染组随着华法林干预浓度的增加，F9相对活性均下降；然而随着华法林干预浓度的增加，F9相对活性下降趋势由小到大排序依次为：FV-M2转染组、FV-M1转染组以及FVZ转染组。 结论： 1、临床上对于山西地区患者，经验性选择已发表模型预测华法林剂量时，第一步可优先选择OHNO模型进行剂量估算。对于使用OHNO模型预测得到华法林使用剂量(≤3mg/d)或(gt;5mg/d)的患者，可进一步使用HUANG或KIM模型进行更准确的剂量估算。VKORC1基因型、是否合并房颤、是否合并心力衰竭/心肌病状态、CYP2C9基因型、BMI、性别以及是否存在血清白蛋白低下等7个因素能显著影响华法林的用药剂量，临床医生在临床实践中应密切关注这些临床因素，以优化中国患者的华法林剂量调整策略。 2、配对样本t检验、Pearson相关性分析以及MAE分析结果均表明，以√W0D为因变量的线性回归方程具有较好的预测准确性，即√W0D=1.265+0.408X1+0.007X2-0.166X3-0.237X4,R2=0.448,其中X1代表VKORC1基因型，X2代表体重，X3代表合并房颤，X4代表CYP2C9基因型；将方程中的√W0D转换为WOD后得到基于VKORC1基因多态性的山西地区患者华法林剂量预测模型WOD=(1.265+0.408X1+0.007X2-0.166X3-0.237X4)2，当VKORC1基因型为AA、AG和GG时赋值分别为0、1、2；当CYP2C9基因型为*1/*1、*1/*3和*3/*3时赋值分别为0、1、2；合并房颤时赋值为1，否则赋值为0；体重为患者实际体重，单位为(kg)；该模型可解释44.8%的WOD个体间差异，其中VKORC1基因型权重占比最大为29.7%，远高于其它因素。 3、尽管针对WOD以及三种WOD变换值(lgWOD、1/WOD、√W0D)分别进行了多元线性回归分析，但最终得到的最佳回归模型其预测准确性仅为44.8%，处于中等水平。然而将217例患者中√W0D异常高的3个点剔除后再次进行回归分析，其结果显示进入回归方程的影响因素种类未发生改变仍为VKORC1基因型，体重，合并房颤状态以及CYP2C9基因型，但回归方程的预测准确性却提高到了52.3%，说明线性回归预测模型中混杂华法林剂量需求异常增高的患者是导致回归模型预测准确性普遍偏低的重要原因，而在上述四种因素中VKORC1基因型是权重占比最大的因素(29.7%)。因此，深入挖掘VKORC1氨基酸序列改变引发的蛋白质空间构象变化是研究华法林药物抵抗的重要切入点。 4、通过对124名山西地区患者的VKORC1基因进行测序，筛选发现两种SNP可导致VKORC1氨基酸序列发生改变。这两种SNP突变位置及类型分别是chr:16:31093398(197Tgt;A)，发生率为0.81%(1/124)和chr:16:31093392(203Agt;G)，发生率为1.61%(2/124)。chr:16:31093398(197Tgt;A)突变将引起VKORC1第66位氨基酸由缬氨酸变为谷氨酸(V66E)；chr:16:31093392(203Agt;G)突变将引起VKORC1第68位组氨酸变为精氨酸(H68R)。在随后的MD模拟程序中进一步推测出VKORC1发生第H68R突变会导致原有的氨基酸互作关系发生变化，从而引起(R/S-)华法林与VKORC1的结合能力下降。考虑到人体环境的复杂性及体内生化反应的多样性，针对MD模拟结果进行实验验证是十分必要的。 5、本研究建立了一种新的基于细胞培养的F9-VKORC1共表达系统，该系统使用共同表达人类F9和VKORC1基因的质粒载体对HEK293T细胞进行转染，使两种蛋白在细胞中分别过表达。通过考察F9因子抗原水平、相对活性对华法林干预浓度的浓度依赖性，表明基于HEK293T细胞培养的F9-VKORC1共同表达质粒载体系统可以通过检测F9因子的相对活性来间接表征华法林与VKORC1的结合强弱情况。该分析模型避免使用非生理性还原剂DTT进行体外驱动实验，可以更加准确地考察华法林与VKORC1的结合情况。此外，该分析模型可用于研究由VKORC1基因SNP突变引起的任何单个VKORC1氨基酸改变对酶活性的影响，因此可成为未来研究VKORC1基因变异与华法林耐药间相互关系的重要工具。 6、通过对F9-VKORC1质粒载体进行点突变诱导构建VKORC1突变型质粒载体（FV-M1表达的VKORC1第66位氨基酸由V→E；FV-M2表达的VKORC1第68位氨基酸由H→R）。随后，利用已建立的F9-VKORC1共表达质粒载体分析模型，在细胞水平上考察VKORC1分别发生V66E，H68R氨基酸突变后与华法林的结合情况。研究结果表明，FV-M2转染组F9因子相对活性下降趋势小于FV-M1转染组以及FVz组，说明VKORC1发生H68R突变将导致华法林与其结合力下降，从而减弱华法林对维生素K循环的抑制，导致系统中F9的相对活性下降趋势放缓。本研究发现并验证了一个可导致华法林发生药物抵抗发生的VKORC1基因2号外显子区SNP突变chr:16:31093392(203Agt;G)，该发现可为以后筛选华法林药物抵抗患者提供重要理论支持。除此之外，未来发现更多可显著影响华法林用药剂量的基因突变并将它们同时纳入用药剂量预测模型是提高华法林精准化用药的关键。
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