摘要
磁性Fe3O4纳米粒子因其具有超顺磁性、生物相容性好、比表面积大、易于从反应体系中分离等特点在酶固定化方面具有良好的应用前景。过氧化氢酶（CAT）具有将过氧化氢转化为水和分子氧的能力，并具有抗氧化应激的作用，可以有效的保护生物体，广泛地应用于食品加工、纺织造纸等领域。β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GUS）主要作用于底物的糖苷键，可以水解甘草酸（GL）的葡萄糖醛酸键生成有更多药理活性的甘草次酸（GA），在医药领域具有一定的前景。酶的固定化可以提高其热稳定性、操作稳定性而实现可重复使用性，降低反应成本。 本文利用超顺磁性Fe3O4纳米粒子对CAT和β-GUS进行固定化研究，主要工作如下： （1）将表达CAT的目的基因katE进行改造并重组到质粒载体pET28a-His上，并转入E.coliBL21（DE3）中，经诱导表达，获得在氨基和羧基各修饰6×HisTag的CAT。将该CAT直接固定在溶剂热法合成的磁性Fe3O4纳米粒子上，获得的固定化酶（Fe3O4-CAT）。但Fe3O4-CAT存在难以从反应体系中分离的问题，应用受到一定限制。 （2）将磁性Fe3O4纳米粒子经过修饰过渡金属离子Ni2+，得到Fe3O4@Ni纳米粒子，Ni2+和CAT的His通过金属之间的螯合作用固定（Fe3O4@Ni-CAT），通过条件优化，固定化酶量达到376.12mg/g，固定化酶活性达到4946U/g。采用响应面法Box-Behnken(BBD)中心组合设计三因素三水平实验，选取反应温度（X1）、溶液pH（X2）和底物浓度（X3）为影响因素，对Fe3O4@Ni-CAT的催化H2O2反应进行优化，得到最佳反应条件为：反应温度40℃，pH为6.4，底物浓度为14.5mmol/L，当加入0.025gFe3O4@Ni-CAT对H2O2清除率为84.32%，与拟合结果83.63%基本一致。重复使用10批次H2O2的清除率仍保持其初始的69.07%，具有一定的可重复使用性。 （3）将磁性Fe3O4纳米粒子经过十六烷基季铵盐（CTAC）修饰得到Fe3O4@CTAC纳米粒子，Fe3O4@CTAC纳米粒子固定在E.coliBL21（DE3）上，即β-GUS原位固定于E.coliBL21（DE3）细胞内（GUS@C@Fe3O4）。制备GUS@C@Fe3O4最佳固定化条件为反应2h、菌含量（干重）6g/L，温度30℃，pH为5。GUS@C@Fe3O4酶活的最适温度为40℃、pH为5；并且相比于游离细胞内的β-GUS有较好的热稳定性和pH稳定性。通过对GUS@C@Fe3O4催化水解甘草酸生产甘草次酸的反应进行了优化，在反应时间2h的条件下温度40℃、pH为5时甘草酸的转化率最高达到88.28%。重复使用5批次转化率保持在73.03%，具有一定的可重复使用性。
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