摘要
丙氨酸作为20种基本氨基酸之一，有D型和L型之分，L-丙氨酸和D-丙氨酸在食品、医药和化妆品领域都有广泛应用。本文以CorynebacteriumglutamicumATCC13032rpsLK43R为出发菌株，采用自杀质粒pK18mobrpsL介导的谷氨酸棒杆菌的基因编辑系统进行基因组编辑，分别构建了一株L-丙氨酸工程菌株和D-丙氨酸工程菌株。 为了强化L-丙氨酸的合成，引入外源L-丙氨酸脱氢酶，通过带质粒的形式过表达不同来源的alaD基因，最终确定效果最好的是来源于枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶，将其三拷贝整合到出发菌的基因组上，L-丙氨酸产量大幅提高。在较高产量的基础上整合了大肠杆菌来源的丙氨酸输出基因alaE，加快L-丙氨酸的输出，同时敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，导致生长变弱，产量降至一半，但是为了避免副产物乳酸的积累，敲除ldhA是必要的。 在iolR位点用Psod启动子过表达葡萄糖激酶基因glk1，强化葡萄糖摄取，L-丙氨酸产量回升至没有敲除ldhA的水平，并继续整合双拷贝的ptsG基因，加快葡萄糖的运输与利用。强化糖酵解关键酶基因gapA的表达，随后引入来自大肠杆菌ED途径关键酶基因edd和eda，L-丙氨酸产量逐渐升高，最终5L发酵罐丙氨酸产量达到104g/L。通过手性柱测试发现含有D-丙氨酸39g/L左右，占了总产量的2/5。 继续研究发现谷氨酸棒杆菌对D-丙氨酸的耐受性较高，因此尝试构建一株D-丙氨酸的谷氨酸棒杆菌生产菌株。首先引入外源二氨基庚二酸脱氢酶StDAPDH，使在敲除丙氨酸消旋酶基因alr和丙氨酸转氨酶基因alaT的基础上D-丙氨酸产量大幅度升高，随后根据L-丙氨酸的改造策略，在iolR位点过表达葡萄糖激酶基因glk1和整合eddeda基因，经5L自动控制发酵罐进行分批补料发酵实验扩大培养，最终D-丙氨酸的产量达到58g/L。 基于StDAPDH的催化机制，以D-缬氨酸为例，在出发菌基因组上整合双拷贝ilvBNC操纵子后，通过敲除关键基因avtA和ilvE，并过表达dapDHSt基因，得到D-缬氨酸3g/L；除此之外，对于非丙酮酸族的氨基酸，以D-谷氨酸为例，引入D-谷氨酸转氨酶，以D-丙氨酸为氨基受体，摇瓶发酵D-谷氨酸最高有1.8g/L。
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