摘要
生殖健康是种族延续和子代健康的基础。人群广泛暴露于大气污染是生殖健康的重大威胁。基于自然生育人群的研究发现大气污染可影响男性和女性的生育力，并且与子代出生缺陷增多有显著关联。采用试管婴儿即体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）出生人群逐年增多，但大气污染暴露与采取IVF-ET助孕女性的临床妊娠结局研究鲜有报道，另外大气污染对IVF-ET出生人群的出生缺陷的影响未见专门研究。大气污染也是男性精子质量下降的高危因素，精浆总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）及睾酮是否也受大气污染暴露影响，且精浆T-AOC和脂质过氧化物产物MDA是否介导了大气污染关联的精子质量下降待进一步研究。铁死亡是一种氧化应激性细胞死亡，本研究也探索了铁死亡在大气污染导致的雄性生殖系统损伤的作用及相关机制。 第一部分大气污染与试管婴儿临床妊娠结局的相关性研究 目的：探讨IVF-ET助孕女性暴露大气污染物与其临床妊娠结局的关联，探索对大气污染物暴露敏感的时间窗。 方法：回顾性纳入自2014年8月至2019年8月于河北某三甲医院生殖医学科行IVF-ET新鲜周期助孕女性。根据河北省149个大气质量监测站的数据，以时空克里金模型预测女性家庭住址的PM2.5、PM10、NO2、SO2、CO和O3暴露水平。并根据卵泡生长和胚胎发育的阶段划分5个暴露时间窗：Period1包括了从窦前卵泡到窦卵泡发育的阶段、Period2包含了应用促性腺激素阶段；Period3包括精卵结合至胚胎发育的第3天；Period4包含胚胎与子宫内膜相互作用至植入子宫内膜的阶段；Period5包括了从始基卵泡到卵泡成熟的整个卵泡发生过程、胚胎体外培养、胚胎移植直到生化妊娠阶段。以广义估计方程模型评估大气污染物和IVF-ET临床妊娠结局关联程度，并探索IVF-ET临床妊娠结局对大气污染物暴露敏感的时间窗。同时通过分层分析揭示对大气污染物暴露敏感的人群。 结果：本研究共纳入9001名女性，实施10467IVF-ET周期。通过评估不同暴露时间窗的个体污染物暴露水平与临床妊娠结局的关联，发现在窦前卵泡到窦卵泡发育的阶段暴露于PM2.5、PM10、NO2、SO2、CO与IVF-ET临床妊娠概率下降关联显著：PM2.5（OR=0.95,95%CI:0.90,0.99）、PM10（OR=0.93,95%CI:0.89,0.98）、NO2（OR=0.89,95%CI:0.85,0.94）、SO2（OR=0.94,95%CI:0.90,0.98）、CO（OR=0.93,95%CI:0.89,0.97），而O3与IVF-ET临床妊娠概率呈正向关联(OR=1.08,95%CI:1.02,1.14)。根据年龄分层后发现20-29岁女性对窦前卵泡期向窦卵泡期过渡阶段的大气污染物暴露敏感，而36-47岁女性对胚胎阶段大气污染物暴露敏感。 小结：1.女性暴露于大气污染物与IVF-ET妊娠可能性下降有显著关联；2.20-29岁女性对窦前卵泡期向窦卵泡期过渡阶段的大气污染物暴露敏感；3.36-47岁女性对胚胎阶段大气污染物暴露敏感。 第二部分大气污染物与试管婴儿出生缺陷的关联分析 目的：探讨女性暴露于大气污染物与IVF-ET助孕妊娠胎儿的出生缺陷的关联。 方法：本研究纳入河北省三家主要生殖医学科自2014年至2019年行IVF-ET助孕后获得临床妊娠病例。根据河北省149个大气监测站的空气质量数据，利用时空克里金模型，预测患者家庭地址的PM2.5、PM10、NO2、SO2、CO和O3暴露水平。暴露时间窗根据卵子、胚胎、胎儿发育阶段分为：窦前卵泡期、窦卵泡期、原始胚胎期、胚胎期和胎儿发育早期。采用广义估计方程关联不同暴露时间窗的大气污染物水平与IVF-ET助孕妊娠人群总出生缺陷和不同器官出生缺陷，并用阴性暴露对照的方法检测和纠正关联估计值偏倚。 结果：本研究共纳入16353对行IVF-ET助孕夫妇，实施16971例IVF-ET周期，共有21655例活产儿、338例死产和108例终止妊娠，其中258周期IVF-ET导致272例出生缺陷。结果显示在胎儿发育早期（孕10-12周）暴露于PM2.5和PM10与总出生缺陷概率增加有关联：PM2.5每增加10μg/m3，出生缺陷的风险OR:1.05,95%CI:1.02–1.09,P=0.013；PM10每增加10μg/m3，出生缺陷的风险OR:1.03,95%CI:1.01–1.06,P=0.021。原始胚胎期和胎儿发育早期暴露于PM10与唇腭裂的风险增加有关联。眼耳面颈部畸形与窦前卵泡期的CO暴露有显著关联。未发现大气污染物与染色体异常的关联。 小结：女性暴露于大气污染物与试管婴儿出生缺陷的增加有关联，尤其是在孕10-12周的暴露于PM2.5和PM10与总出生缺陷增加显著关联。大气污染暴露与唇腭裂和眼耳面颈部畸形风险增加有显著关联。 第三部分大气污染与精子质量的关联分析及精浆MDA、T-AOC的中介作用研究 目的：探讨大气污染物暴露与精子质量的关联，以及精浆氧化应激标志物在大气污染物关联的精子质量下降的作用。 方法：本研究招募自2020年3月至2020年8月就诊于河北某三甲医院生殖医学科因女方因素准备行试管婴儿助孕的男性。检测男性精液常规参数包括精液体积、精子浓度、活动率、前向运动率、正常形态率和精浆丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）及精浆睾酮。采用反距离权重法（IDW）评估个体大气污染物暴露水平。根据精子发生过程划分为减数分裂期、精子形成期、附睾期以及总生精期。采用多重线性回归分析大气污染物与精液常规参数、MDA、T-AOC和精浆睾酮的关联，并探索MDA、T-AOC与大气污染物暴露关联的精子质量下降中的中介效应。 结果：本研究共计纳入524名男性，发现在附睾期，PM10暴露与精子浓度、活动率、前向运动率下降有显著关联；PM2.5暴露与精子活动率和前向运动率呈负相关，在总生精期，CO与精子的正常形态呈负关。在附睾期和总生精期PM2.5、PM10、NO2暴露与精浆MDA上升有显著关联；附睾期PM2.5、PM10暴露与T-AOC下降呈显著关联；总生精期PM2.5、PM10、CO暴露与睾酮升高呈显著关联。中介分析发现T-AOC和MDA部分介导了附睾期PM10暴露关联的精子活力下降。 小结：大气污染与男性精子质量下降呈显著关联；大气污染与精浆MDA升高、T-AOC下降及睾酮升高有显著关联；T-AOC和MDA部分介导了PM10暴露相关的精子活力下降。 第四部分FDX1介导的Leydig细胞铁死亡在PM2.5致小鼠睾丸功能损伤的机制研究 目的：明确PM2.5暴露所致雄性小鼠生殖系统损伤；探索对PM2.5暴露敏感的睾丸组织靶细胞；揭示铁死亡在PM2.5暴露致小鼠睾丸损伤中的作用及相关机制。 方法：建立实时动态小鼠PM2.5暴露模型，分为洁净组（FA）、大气组（UA）和浓缩PM2.5组（CA）；同时建立铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）干预模型，包括DMSO+FA组、DMSO+CA组、Fer-1+FA组和Fer-1+CA组。暴露16周后检测小鼠睾丸功能相应参数，包括精子质量、睾酮水平及睾丸病理。流式细胞术方法检测睾丸细胞脂质过氧化物水平，试剂盒法检测组织丙二醛（MDA）和二价铁比例，并通过睾丸组织免疫荧光染色检测脂质过氧化物产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）和铁蛋白重链（FTH1）在睾丸组织分布。根据在组织中发现的PM2.5靶细胞建立靶细胞的PM2.5染毒模型（暴露浓度为0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）和铁死亡抑制剂Fer-1干预模型（PM2.5暴露浓度为200μg/ml，分为DMSO组、DMSO+PM2.5组、Fer-1组和Fer-1+PM2.5组），检测脂质过氧化物、MDA、二价铁离子、谷胱甘肽及免疫印迹实验检测铁死亡相关蛋白等指标确认铁死亡的发生及在靶细胞死亡中的作用，并探索PM2.5暴露致靶细胞铁死亡相关的机制。 结果：PM2.5暴露后CA组较FA组小鼠附睾精子数量和活力均显著下降（P＜0.01）而睾酮水平却异常升高（P＜0.05）。睾丸组织切片行4-羟基壬烯醛（4-HNE）和铁蛋白重链1（FTH1）免疫荧光染色后发现其均主要表达于睾丸间质，与FA组相比在CA组显著表达增多（P＜0.01）。在使用铁死亡抑制剂Fer-1干预后，Fer-1+CA组较DMSO+CA组精子质量的下降显著缓解（P＜0.05），睾酮升高幅度显著减少（P＜0.05），且4-HNE和FTH1在睾丸间质细胞（Leydig细胞）的表达水平显著下降（P＜0.05）因此推测睾丸Leydig细胞是PM2.5暴露的靶细胞。 观察小鼠睾丸间质细胞系TM-3细胞暴露于PM2.5后，相较于阴性对照组细胞活力显著下降（P＜0.05），细胞内活性氧（ROS）、脂质过氧化物、二价铁水平显著升高（P＜0.01），且具有剂量依赖性。免疫印迹实验显示谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、铁死亡抑制蛋白1（FSP1）和铁蛋白重链1（FTH1）表达水平随着PM2.5暴露剂量而升高（P＜0.05）。铁死亡的标志物环加氧酶2（PTGS2）的mRNA表达水平在PM2.5浓度为200μg/ml组较阴性对照组显著升高（P＜0.001），综上证实铁死亡参与了PM2.5暴露导致的TM-3细胞死亡。而使用Fer-1干预后，Fer-1+PM2.5组细胞活力较DMSO+PM2.5组下降幅度减轻（P＜0.05），且该效应不能被凋亡抑制剂和坏死抑制剂复现。细胞内ROS、脂质过氧化物、细胞内二价铁在Fer-1+PM2.5组较DMSO+PM2.5组升高幅度显著减小（P＜0.05）。因此证实铁死亡在PM2.5致TM-3细胞死亡中占主要作用。 在PM2.5暴露后细胞培养基上清中检测到睾酮和孕酮上升，尤其在PM2.5为200μg/ml组较阴性对照组睾酮和孕酮显著上升（P＜0.001）。睾酮合成过程中的限速酶-类固醇生成急性调节蛋白（StAR）在PM2.5暴露浓度为100μg/ml和200μg/ml组较阴性对照组表达水平显著升高（P＜0.05），同时发现在睾酮合成过程中负责向胆固醇侧链裂解酶CYP11A1传递电子的铁氧还蛋白（FDX1）在PM2.5浓度200μg/ml组较阴性对照组表达水平显著升高（P＜0.001）。Fer-1干预PM2.5暴露的TM-3细胞后发现睾酮和孕酮在Fer-1+PM2.5组较Fer-1组显著升高（P＜0.01），但孕酮升高的幅度在Fer-1+PM2.5组较DMSO+PM2.5组显著下降（P＜0.05）。免疫印迹实验发现StAR在Fer-1+PM2.5组较DMSO+PM2.5组无显著变化（P＞0.05）,FDX1在Fer-1+PM2.5组较DMSO+PM2.5组显著降低（P＜0.05）,动物的体内实验与TM-3细胞体外实验结果相似。因此我们假设FDX1可能在PM2.5所致的Leydig细胞铁死亡中发挥一定作用。 采用siRNA干扰在TM-3细胞敲低FDX1后发现siFDX1+PM2.5组暴露的细胞活力较siCtrl+PM2.5组显著上升（P＜0.05），使用铁死亡激动剂Erastin发现，FDX1可以挽救Erastin暴露导致的细胞死亡（P＜0.0001）。睾酮在siFDX1+PM2.5组较siCtrl+PM2.5组无显著变化（P＞0.05），而孕酮在siFDX1+PM2.5组较siCtrl+PM2.5组显著降低（P＜0.05）。细胞内ROS、脂质过氧化物和二价铁离子在siFDX1+PM2.5组较siCtrl+PM2.5组显著降低（P＜0.05）且发现siFDX1组较siCtrl脂质过氧化物和二价铁离子显著降低（P＜0.05），即敲低FDX1即可降低细胞内脂质过氧化物和二价铁离子。免疫印迹实验证明GPX4和FTH1在siFDX1+PM2.5组较siCtrl+PM2.5组显著降低（P＜0.05），因此证明FDX1介导了PM2.5暴露导致的睾丸Leydig细胞铁死亡。 小结：1.小鼠暴露于PM2.5会引起睾丸功能损伤，包括精子质量下降和睾酮异常升高；2.铁死亡参与了PM2.5暴露致小鼠睾丸功能损伤；3.PM2.5暴露导致小鼠睾丸Leydig细胞铁死亡；4.FDX1介导了PM2.5暴露导致的Leydig细胞铁死亡，同时促进了睾酮合成。
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