摘要
【目的】 1.通过构建由DNA纳米线介导的催化发夹组装技术（Nanowireguided-catalytichairpinassembly,NgCHA）实现对细胞外囊泡的穿透，及EV-miRNA信号扩增，从而对EV-miRNA进行灵敏、高效的原位检测。 2.探究NgCHA纳米探针检测血浆EV-miRNA对癌症早期诊断、复发风险评估的临床应用。 【方法】 1.设计发夹序列，在NUPACK网站上预测发夹结构评估热力学稳定性；通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及荧光验证NgCHA检测miRNA的可行性，并优化实验条件。 2.通过碰撞理论的计算和荧光实验对NgCHA纳米探针进行反应效率、灵敏度、荧光动力学和特异度的性能评价分析。 3.采用超速离心法提取细胞培养上清液中的细胞外囊泡，通过电镜、蛋白电泳和纳米颗粒跟踪分析对提取的样本进行表征；应用超分辨率显微镜和荧光实验验证NgCHA进入细胞外囊泡检测miRNA，与金标准RT-qPCR进行对比。 4.通过所建立的方法检测血浆样本中提取的EV-miRNA，探究乳腺癌早期诊断和复发风险评估的临床应用。 【结果】 1.NgCHA中的纳米线由Trigger链和L1、L2链组成，催化发夹自组装部分由H1、H2链组成，H1、H2链能组装在纳米线上，并成功被靶标触发CHA反应。 2.NgCHA纳米探针的最小反应体积比传统催化发夹组装探针低3150倍，灵敏度可达0.144pM，能够识别不同浓度的靶标，并且具有良好的特异性。 3.成功提取MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、MCF-10A细胞的细胞外囊泡，并验证NgCHA进入细胞外囊泡检测EV-miRNA，以检测MDA-MB-231细胞外囊泡的miR-1246为例，其最灵敏度可达2×106个颗粒/μl。与金标准RT-qPCR方法比较，分别检测上述四个细胞系的EV-miR-1246，其趋势具有良好的一致性（R2=0.983）。 4.检测健康者和乳腺癌患者EV中miR-1246、miR-375、miR-221、miR-21用于乳腺癌诊断，单项检测AUC在0.75~0.87，四项联合检测AUC可达0.965，早期诊断AUC为0.939。将乳腺癌患者分为低危组、中危组和高危组，通过深度学习随机森林算法，能够将三组进行判别，其预测准确率可达82%。 【结论】 1.构建了由纳米线介导的催化发夹自组装技术（NgCHA），并优化了实验条件。 2.NgCHA纳米探针的反应效率和灵敏度优于传统的催化发夹自组装技术，并且具有良好的荧光动力学特性和特异性。 3.NgCHA纳米探针可进入细胞外囊泡原位检测EV-miRNA，并且与金标准RT-qPCR方法的检测趋势具有一致性。 4.在临床样本检测中，验证了NgCHA具有乳腺癌早期诊断和复发风险评估的临床应用潜力。
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