摘要
肌氨酸是一种N-甲基化的氨基酸，在日用化学品、养殖、食品、保健以及医学等领域应用前景广泛。肌氨酸具有作为脑科术后以及脑部损伤的恢复药物的潜力以及抗精神病药物的潜力，可以被开发为保健品、运动饮料的成分以及饲料成分。目前肌氨酸的合成方法主要是化学合成法，但是存在原料运输成本高、有毒、反应条件苛刻、危险性过高等问题，因此可以利用生物法替代化学法用于肌氨酸的合成。 亚胺还原酶DpkA可以使用乙醛酸和甲胺为底物，以NADPH为还原力催化肌氨酸的合成，但利用酶催化法合成肌氨酸的成本较高。微生物发酵法具有成本较低、原料常见、条件易控制且环境友好的特点，是一种非常绿色的合成技术，已普遍应用于氨基酸的生产，因此本研究开发了一种利用重组大肠杆菌从头合成肌氨酸的方法。 本研究构建了一株能够利用葡萄糖和甲胺发酵生产肌氨酸的大肠杆菌基因工程菌。首先，以含有由PxylF启动子控制的T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌为出发菌，敲除了乙醛酸循环抑制基因iclR，开启乙醛酸循环；增加了柠檬酸合酶编码基因gltA的拷贝数，增强了乙醛酸循环的通量；将关键基因dpkA整合入基因组中，表达了关键酶DpkA，使菌株能够合成肌氨酸。其次，敲除了苹果酸合酶基因aceB，阻断了乙醛酸到苹果酸的代谢；增加了异柠檬酸裂解酶基因aceA的拷贝数，增强了异柠檬酸到乙醛酸的代谢；敲除了乙醛酸还原酶基因ycdW，阻断了乙醛酸到乙醇酸的代谢，提升了肌氨酸的产量。随后，增加膜结合转氢酶基因pntAB的拷贝数，增强了还原力NADPH的供应。最后，增加了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc的拷贝数，增强了磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的代谢；敲除了丙酮酸激酶基因pykF，减弱了磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的代谢，减少了副产物N-甲基丙氨酸的合成，肌氨酸产量得到进一步的增加。通过上述改造策略构建的菌株SAR7，摇瓶发酵肌氨酸产量达到了0.427g/L。 在5L发酵罐中，在OD600达到40时以25mL/h的流速流加1.2mol/L的甲胺盐酸盐溶液，总流加量为95mL/L培养基直至发酵结束，发酵24h后菌株SAR7可以产生1.2g/L的肌氨酸。
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