摘要
罗汉果苷（mogrosides）是一种重要的三萜类天然产物，可作为低热量的高倍甜味剂，同时也具有独特的药理活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化及抗衰老等作用。在罗汉果中存在的罗汉果苷是以罗汉果醇作为苷元由糖基转移酶（glycosyltransferases,GTs）催化糖基化反应而形成，糖基化修饰程度直接影响了罗汉果苷的甜度、水溶性和药理活性。目前，报道的催化罗汉果苷的糖基转移酶较少且酶活性较低，无法满足罗汉果苷的生物制备，因此，挖掘新型糖基转移酶基因，实现罗汉果醇的多级糖基化修饰，对于生物法合成罗汉果苷具有重要意义。 本研究围绕前期实验室建立的糖基转移酶库和文献中报道的糖基转移酶基因，开展罗汉果苷糖基化修饰研究，筛选得到多条具有不同催化活性的糖基转移酶（UGT-MG1、UGT-MS1和UGT-MS2），并对得到的糖基转移酶进行大肠杆菌异源表达、纯化及酶学性质分析，其结果显示了三条糖基转移酶的最适反应温度范围为40-50℃，催化反应的pH为中性偏碱性（7.0-8.0），建立了体外多酶催化罗汉果苷合成体系；对三个酶的动力学常数（Km、kcat等）分析测定发现，UGT-MG1和UGT-MS1对罗汉果苷的亲和力高于UGT-MS2，导致了UGT-MS2对罗汉果苷的催化效率较低。 利用不同的罗汉果苷对三个酶的催化功能进行底物谱的筛选，UGT-MG1可以催化罗汉果苷的一级糖基化，实现了罗汉果醇到罗汉果苷ⅡE的完全转化；UGT-MS1同时具有催化罗汉果苷一级糖基化和二级糖基化的能力，但是在罗汉果苷二级糖基化过程中，仅可催化β(1,6)糖苷键的合成；UGT-MS2能催化罗汉果苷二级糖基化且产物类型复杂，在初步解析该酶催化功能后，对该酶催化产生的未知产物鉴定发现其具有催化C3-O-Glc合成β(1,2)糖苷键的能力，利用三酶级联反应催化罗汉果苷转化，其中甜苷Ⅳ与甜苷Ⅴ的转化率分别为45%与5%，其它成分主要以罗汉果苷Ⅲ形式存在。 为了提高罗汉果甜苷的糖基化修饰效率，针对糖基转移酶UGT-MS2进行分子改造，获得优势突变体（MS2-F379A），分析测定了该突变体动力学常数，其催化活性提高2.62倍；进一步将改造获得突变体MS2-F379A和UGT-MG1、UGT-MS1进行级联催化罗汉果苷合成，结果发现产物中均为罗汉果甜苷（Ⅳ+Ⅴ），实现了罗汉果苷由苦味到甜味的生物转化。此外，通过对糖基转移酶三萜类底物谱筛选，发现UGT-MG1对葫芦素也具有良好的催化活性，为三萜类化合物糖基化修饰提供高效的酶元件。 本研究通过对糖基转移酶基因的挖掘和功能验证，筛选到具有催化罗汉果苷一级糖基化和二级糖基化的糖基转移酶。基于分子改造得到的催化活性提高的UGT-MS2酶突变体，极大地提升了体外多酶转化罗汉果苷的效率，实现了罗汉果甜苷的完全转化。本研究不仅为三萜糖苷的合成提供了多条糖基转移酶功能元件，同时为罗汉果苷的生物合成奠定了基础，对于罗汉果苷等天然产物的合成具有重要的意义。
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