摘要
【目的】 1.构建含趋化因子2(C-CChemokines2，CCL2)的新型复合材料支架，探究支架孔径特征及CCL2缓释规律。 2.提取并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（Bonemesenchymalstemcells，BMSC），探究CCL2对其增殖及成骨分化的影响。 3.构建大鼠股骨缺损模型，应用含聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA）、β-磷酸三钙（β-TricalciumPhosphate，β-TCP）、甲基丙烯酰化明胶（Gelatinmethacryloyl，Gelma）水凝胶、CCL2不同成分的复合材料支架进行骨缺损修复，观察含有CCL2的复合材料支架成骨修复效果。 【方法】 1.以课题组研发及前期研究使用的PLGA/β-TCP支架，通过10%Gelma水凝胶将CCL2负载上支架中制成新型复合材料支架，通过扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）测定所使用支架的孔径特征。采用Elisa检测试剂盒分析CCL2释放规律。 2.从3周龄SD大鼠股骨骨干中用全骨髓法提取原代骨髓间充质干细胞，通过倒置相差显微镜观察细胞铺展情况，培养至P3代采用流式细胞技术对所培养原代细胞进行细胞表型鉴定。采用不同浓度CCL2培养基培养骨髓间充质干细胞；细胞计数试剂（CellCountingKit-8，CCK-8）、茜素红试剂染色方法观察细胞增殖和钙化效果。 3.选取32只3月龄雄性SD大鼠称重（400±30）g，随机分为A组（单纯骨缺损区域）、B组（骨缺损区域放置PLGA/β-TCP支架），C组（骨缺损区域放置Gelma水凝胶/PLGA/β-TCP支架），D组（骨缺损区域放置CCL2/Gelma水凝胶/PLGA/β-TCP支架）每组各8只。构建SD大鼠股骨骨缺损模型，术后4、8周进行取材。取材后使用多聚甲醛固定48h后70%乙醇保存，再将组织分别进行micro-CT扫描测定，组织形态学染色及免疫组化分析，评估CCL2复合支架成骨修复的效果。 【结果】 1.B组、C组、D组所用支架材料平均孔径分别为530±111μm、500±84μm、540±80μm，D组放大600及1000倍的SEM图片中，可以看到CCL2所呈现的颗粒样物质很好被覆盖在在支架材料表面；B组、C组和D组支架材料均值孔隙率分别为69.3±4.2%、64.8±3.5%、67.1±3.1%。 药物缓释实验提示CCL2释放周期可达到2周，并在第14d达到最大释放峰值，累计释放百分比可达63%-71%。 2.显微镜下观察可见3周龄大鼠骨髓间充质干细胞48h后可少量贴壁，可见少量组织漂浮于培养基中，每2-3d换液并培养至10d左右时视野明显清晰，细胞贴壁80%-90%。培养至第3代时行流式细胞分析示细胞表型CD44H、CD90为阳性，而CD11b/c为阴性，符合骨髓间充质干细胞表面标志，代表提取原代细胞成功。 CCK-8实验示高浓度CCL2（200ng/ml，250ng/ml）处理BMSC后第3、4d时细胞活性呈显著增强趋势，并且250ng/ml浓度时CCL2表现更强细胞增殖活性，作用效应在一定浓度下呈剂量依赖性。 茜素红染色结果示CCL2能诱导BMSC聚集，使细胞向中心移动生长进而增加钙盐的沉积数量，随CCL2作用浓度升高而染色逐渐加深，有更多的茜素红结节染色，钙结节增加趋势随着CCL2剂量的增大而明显，说明高浓度的CCL2促进BMSC的矿化效果更佳，作用效应在一定浓度下呈剂量依赖性。 3.micro-CT扫描结果分析：8周取材的股骨样本骨重建程度都明显强于4周取材样本；且在相同的取材时间，8周取材股骨样本的骨密度和骨体积分数值显著强于4周取材股骨样本。在新生骨形成数量上，D组新生骨数量更多，高于A、B、C组。同时，在8周取材样本中D组还表现出了更优质的重建骨形态，骨的重塑已接近正常骨，而在于A、B、C组中，骨断端之间还存在明显的间隙。4周及8周取材时的D组骨密度（Bonemineraldensity，BMD）值显著高于A、B、C组（在4、8周时与A、B组相比有显著性差异，P＜0.001；在8周时与C组相比有显著性差异，P＜0.01），同时D组骨体积分数（Bonevolume/Tissuevolume，BV/TV）值也显示了高表达的变化趋势，即D组在4、8周有着最高的骨体积分数值，其值均高于A、B、C组，有统计学差异。 组织形态学苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色：第4周，各组样本缺损处均有着明显的间隙，其中以A组显著，同时在B、C、D组中有成骨细胞分布在材料区域，而在D组中除了可以看到成骨细胞，还能在穿梭在材料间的纤维结缔组织中看到含有红细胞的血管生成。当第8周时，各组矿化效果较第4周好，其中D组较A、B、C组的成骨细胞分布更为连续，矿化组织形成的面积更大，材料本身与新生组织界面的模糊度更高，这表示材料降解也更为明显。D组促进成骨分化与血管生成效果更好。 免疫组化结果示：术后第8周新生骨组织的成骨、成血管指标表达显著高于术后第4周的新生骨组织。第4周时，骨钙素（Osteocalcin，OCN），骨桥蛋白（Osteopontin，OPN），Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscriptionfactor2，RUNX2），血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）在D组的表达量较A、B、C组均高（与A组相比在各抗体上均有显著性差异，P＜0.001；与B组相比在OPN、RUNX2、VEGF上有统计学差异，与C组相比在RUNX2上有统计学差异），同样D组在第8周时也呈现出相同高表达趋势（与A、B组相比在各抗体上均有显著性差异，P＜0.001，与C组相比在OPN上有显著性差异，P＜0.001）。 【结论】 1.10%Gelma水凝胶能将CCL2均匀负载上支架中，且所使用支架的平均孔径和孔隙率利于细胞迁移和粘附，同时CCL2在其中能稳定规律释放。 2.经流式鉴定表明用全骨髓法提取原代BMSC切实有效。CCL2呈剂量依赖性提高BMSC增殖活力及诱导BMSC成骨分化。 3.掺入CCL2的复合材料支架可有效促进SD大鼠骨缺损的成骨修复。
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