摘要
目的：本研究通过利用糖尿病小鼠模型和体外培养人肾小管上皮细胞，探讨碳水化合物反应元件结合蛋白（Carbohydrateresponseelement-bindingprotein，ChREBP）在糖尿病肾脏细胞凋亡、脂质沉积、炎症和纤维化中的作用及调节机制，为糖尿病肾病的防治提供新的治疗靶点和思路。 方法： 1以临床资料完整的糖尿病肾病患者肾组织活检标本为糖尿病肾病（DN）组，以非糖尿病肾脏肿瘤患者的远端肾组织为对照组，免疫组化检测ChREBP和TXNIP在肾脏的表达。 2利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除C57BL/6小鼠ChREBP基因。连续5天向小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ），每次的剂量为50mg/kg，来构建糖尿病模型。注射完毕一周以后检测血糖。血糖高于16.7mmol/L且尿糖呈阳性（+++～++++），即为造模成功。实验分组分为六组：非糖尿病野生型组（Non-diabeticChREBP+/+）、非糖尿病ChREBP基因敲低组（Non-diabeticChREBP+/-）、非糖尿病ChREBP基因敲除组（Non-diabeticChREBP-/-）、糖尿病野生型组（DiabeticChREBP+/+）、糖尿病ChREBP基因敲低组（DiabeticChREBP+/-）和糖尿病ChREBP基因敲除组（DiabeticChREBP-/-）。糖尿病模型造模成功并分别饲养12周、20周和24周以后，测量小鼠体重，留取小鼠血尿标本并检测血生化指标。TUNEL检测肾脏细胞凋亡数目。NileRed和油红O（OilRedO）染色检测各组小鼠肾组织脂滴变化。ELISA检测尿中8-OHdG的含量。Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3和caspase3）、氧化应激水平（HO-1和Nox4）、脂肪酸β氧化相关蛋白（ACOX1、PPARα和CPT1A）、脂肪酸合成相关蛋白（ACC和FASN）、mTORC1的活性（mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K、eIF4EBP1和p-eIF4EBP1）、NLRP3炎症体（NLRP3、ASC、caspase1、IL-18和IL-1β）的活性、炎症相关蛋白（IL-6、MCP-1和TNFα）、胶原蛋白（CollagenⅠ和CollagenⅣ）、fibronectin、α-SMA、E-cadherin、TXNIP、TGF-β1和p-Smad2/3的表达水平。免疫组化检测各组小鼠肾脏Bax、Bcl-2、TXNIP、HO-1、Nox4、8-OHdG、FASN、ACC、ACOX1、CPT1A、p-S6K、p-eIF4EBP1、NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β和TGF-β1的定位和表达。免疫荧光检测PPARα、p-mTOR、IL-6、CollagenI、CollagenIV、fibronectin、α-SMA和E-cadherin蛋白的表达。 3以HK-2细胞（人肾小管上皮细胞）为研究对象，高糖刺激细胞0、6、12、24、48和72小时。Westernblot和RT-qPCR分别检测ChREBP蛋白和mRNA的表达。将HK-2细胞分为三组，分别为正常糖组（NG）、高渗组（M）和高糖组（HG）。WesternBlot和细胞免疫荧光检测ChREBP在HK-2细胞核和浆中的表达及定位。转染ChREBPshRNA且高糖刺激HK-2细胞48h后进行如下实验。实验分组为：正常糖组（NG）、高渗组（M）、高糖组（HG）、高糖+空载质粒对照组（HG+C）和高糖+ChREBPshRNA转染组（HG+ChREBPshRNA）。TUNEL染色检测各组HK-2细胞凋亡情况。MitoSOX和DCFH-DA染色分别通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测线粒体和细胞内ROS的水平。NileRed和OilRedO染色检测HK-2细胞脂质沉积情况。Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、cleavedcaspase3和caspase3）、氧化应激水平（HO-1和Nox4）、脂肪酸β氧化相关蛋白（ACOX1、PPARα和CPT1A）、脂肪酸合成相关蛋白（ACC和FASN）、胶原蛋白（CollagenⅠ和CollagenⅣ）、fibronectin、α-SMA、E-cadherin、TXNIP、TGF-β1和p-Smad2/3的表达以及mTORC1（mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K、eIF4EBP1和p-eIF4EBP1）和NLRP3炎症体（NLRP3、ASC、caspase1、IL-18和IL-1β）的活性。免疫荧光检测TXNIP、PPARα、FASN、ACOX1、CPT1A、p-mTOR、p-S6K、p-eIF4EBP1、NLRP3、ASC、caspase1、IL-18、IL-1β、CollagenⅠ、CollagenⅣ、fibronectin和TGF-β1的表达水平。RT-qPCR检测ChREBP、TXNIP、Bax和Bcl-2mRNA的表达水平。 4⑴TXNIPsiRNA干预高糖刺激的HK-2细胞48h后进行如下实验。实验分组为：正常糖组（NG）、高渗组（M）、高糖组（HG）、高糖+Scramble组（HG+Scr）和高糖+TXNIPsiRNA转染组（HG+TXNIPsiRNA）。TUNEL检测细胞凋亡数目。MitoSOX染色后通过激光共聚焦显微镜检测线粒体内ROS的水平。RT-qPCR检测ChREBPmRNA的表达水平。Westernblot检测ChREBP在细胞核和细胞浆中蛋白的表达。⑵抗氧化药物（NAC或tempol）干预高糖刺激的HK-2细胞48h后进行如下实验。细胞随机分为正常糖对照组（NG）、高渗对照组（M）、高糖组（HG）、高糖+NAC组（HG+NAC）、高糖+tempol组（HG+tempol）。Westernblot和免疫荧光技术检测细胞内ChREBP蛋白的表达及定位。⑶雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）干预高糖刺激的HK-2细胞48h后进行如下实验。细胞随机分为正常糖对照组（NG）、高渗对照组（M）、正常糖+RAPA组（NG+RAPA）、高糖组（HG）、高糖+RAPA组（HG+RAPA）。NileRed和OilRedO染色检测HK-2细胞脂质沉积情况。Westernblot检测mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K、eIF4EBP1、p-eIF4EBP1、FASN、ACC、PPARα、ACOX1和CPT1A的表达水平。 结果： 1ChREBP在糖尿病患者肾组织中的表达 ①与肾脏肿瘤患者远端正常肾组织相比，DN患者肾脏中ChREBP和TXNIP的表达明显上调。②在DN患者肾组织中，ChREBP与TXNIP的表达呈正相关。 2ChREBP对糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡的影响 ①敲低或敲除ChREBP基因能够改善小鼠的血尿生化指标。②敲低或敲除ChREBP减少糖尿病小鼠肾脏细胞凋亡数目，下调cleavedcaspase3和Bax的表达水平，上调Bcl-2的表达水平。③ChREBP缺乏抑制STZ诱导的糖尿病小鼠肾脏TXNIP、Nox4、HO-1和8-OHdG的表达。 3ChREBP对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响及机制 ①ChREBP蛋白和mRNA的表达在高葡萄糖处理的HK-2细胞中呈时间依赖性增高，且在48hChREBP核转位表现明显。②ChREBPshRNA显著降低高糖状态下HK-2细胞TXNIP和Nox4蛋白的表达水平和ROS的产生。③在高糖培养的HK-2细胞中，转染ChREBPshRNA减少细胞凋亡数目，下调Bax/Bcl-2蛋白和mRNA的比值，减少cleavedcaspase3的表达。④TXNIPsiRNA抑制高糖诱导的HK-2细胞ChREBP蛋白和mRNA的表达，ChREBP核转位以及ROS产生和细胞凋亡。⑤给予抗氧化药物（NAC或tempol）能够减少高糖诱导的HK-2细胞ChREBP表达上调和核转位。 4ChREBP在糖尿病肾小管细胞脂质沉积中的作用及机制 ①在敲低或敲除ChREBP糖尿病小鼠肾脏中，脂滴蓄积减少且ACC和FASN蛋白的表达降低。②CPT1A、PPARα和ACOX1蛋白的表达水平在敲低或敲除ChREBP糖尿病小鼠肾脏中显著上调。③敲低或敲除ChREBP抑制糖尿病小鼠肾脏mTORC1的活性。④在高糖培养的HK-2细胞中，转染ChREBPshRNA能够减少脂滴聚集，下调ACC和FASN蛋白的表达。⑤转染ChREBPshRNA能够上调高糖处理的HK-2细胞CPT1A、PPARα和ACOX1的表达。⑥ChREBPshRNA干预抑制高糖诱导的HK-2细胞mTORC1活性。⑦在高糖培养的HK-2细胞中，雷帕霉素（Rapamycin）减少脂滴在细胞内聚集，下调ACC和FASN蛋白的表达，上调PPARα、CPT1A和ACOX1蛋白的表达。 5ChREBP对糖尿病肾脏炎症和纤维化的影响 ①ChREBP缺乏抑制糖尿病小鼠肾脏fibronectin、CollagenⅠ和CollagenⅣ蛋白的表达。②与野生型糖尿病小鼠相比，在ChREBP缺乏糖尿病小鼠肾脏中，α-SMA的表达减少，E-cadherin的表达增多。③ChREBP缺乏降低糖尿病小鼠肾脏TGF-β1蛋白的表达和Smad2/3信号的活性。④与野生型糖尿病小鼠相比，IL-6、TNF-α和MCP-1在敲低或敲除ChREBP的糖尿病小鼠肾组织表达减少。⑤ChREBP缺乏抑制糖尿病小鼠肾脏NLRP3炎症体的激活。⑥ChREBPshRNA干预抑制高糖诱导的HK-2细胞NLRP3炎症体的活性。 结论： 1ChREBP缺乏能够抑制糖尿病肾小管细胞凋亡，这一过程可能通过下调TXNIP蛋白的表达和减少ROS产生来实现的；此外，ROS和TXNIP能够反馈调节高糖诱导的ChREBP表达及活性。 2ChREBP缺乏能够减少糖尿病肾小管细胞脂质沉积；这一过程可能部分是通过抑制mTORC1的活性来实现。 3ChREBP缺乏能够减轻糖尿病小鼠肾间质纤维化和上皮-间质转化（EMT），这一过程可能部分是通过抑制NLRP3炎症体活化，改善肾脏炎症，并抑制TGF-β1/Smad信号来实现的。
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