摘要
原发性醛固酮增多症（primaryaldosteronism，PA）是由肾上腺皮质分泌过多醛固酮（aldosterone），导致血容量增多，潴钠排钾，代谢型碱中毒，临床表现为高血压和低血钾的一组异质性疾病。PA是继发性高血压的常见原因之一，约占高血压人群的10%，占顽固性高血压人群的20%。其中醛固酮瘤（~35%）和特发性醛固酮增多症（~60%）占PA的95%。PA是继发性高血压等心血管疾病的高危险因素，PA患者伴中风、心肌梗塞、房颤等心血管疾病的发生率与死亡率较年龄、性别、血压等都匹配的原发性高血压患者明显升高。然而，高醛固酮血症导致血压升高的机制目前仍然存在争议，单纯水钠潴留导致血容量增多并不是唯一的机制，而近年来高醛固酮血症引起动脉血压升高的中枢机制逐渐被研究人员所重视。 醛固酮是典型的盐皮质激素，主要在肾上腺皮质球状带由胆固醇在一系列氧化还原酶的催化下生成，通过调控血钠和血钾在肾脏的吸收与排泄达到维持体液平衡和血压的稳定。醛固酮主要与盐皮质激素受体（mineralocorticoidreceptor，MR）结合形成复合体，作为转录调控因子的形式进入细胞核发挥基因组效应。研究证明，醛固酮-MR信号通路参与肾血管性高血压、易卒中型自发性高血压、血管紧张素II诱导的高血压、高盐诱导的高血压等多种动物模型高血压的发生与发展。慢性侧脑室（Intracerebroventricular，ICV）给予小剂量醛固酮或其前体物质去氧皮质酮能升高大鼠动脉血压，而全身给予同等剂量的醛固酮/去氧皮质酮并不能引起血压的改变，这种中枢升压效应能被ICV给予MR阻断剂消除。此外，急性或慢性醛固酮处理均能造成动物或人的动脉压力感受器反射钝化。这些研究虽然能证明醛固酮具有中枢升压效应，但由于使用的实验动物模型与临床PA患者的症状相差甚远，并不能完全解释盐皮质激素增多导致高血压的发生与发展机制。近期研究发现，双孔钾离子通道中的TASK-1（TWIK-relatedacid-sensitivepotassiumchannel-1）和TASK-3通道全身敲除小鼠（TASK-/-）表现为高醛固酮血症、高血压、低肾素、盐水负荷实验或血管紧张素Ⅱ受体阻断剂不能抑制醛固酮的过量分泌，这与人群中的特发性醛固酮增多症非常相似。其机制是由于TASK通道敲除后，肾上腺皮质球状带细胞去极化而引起醛固酮过量分泌。因此，TASK-/-小鼠是研究PA较理想的动物模型，获得同领域专家的认可。在此课题中，我们以TASK-/-小鼠作为PA模型，利用清醒动物血压无线遥测等技术结合药理学方法，主要从压力感受器反射、交感神经紧张性等角度揭示高醛固酮血症引起高血压的神经机制。 目的：解析醛固酮-MR信号参与PA高血压的神经机制。主要内容有：（1）明确MR参与PA高血压的发生；（2）判断TASK-/-小鼠是否存在MR依赖的交感神经紧张性增加；（3）分析TASK-/-小鼠是否存在MR依赖的压力感受器反射异常；（4）明确压力感受器反射钝化的中枢靶点。 方法：（1）实验动物，实验选用TASK+/+（C57BL-6J）和TASK-/-成年雄性小鼠（25~30g）；（2）清醒状态下血压测量，应用血压无线遥测装置测量小鼠24h收缩压（SBP）、舒张压（DBP）与心率（HR），验证TASK-/-小鼠是否表现为高血压；（3）血浆醛固酮浓度测定，分别于6:00、12:00、18:00、24:00取两组小鼠尾巴动静脉混合血，用酶联免疫吸附法（ELISA）测各时间点血浆中醛固酮浓度，判断TASK-/-小鼠是否表现为高醛固酮血症，以及观察醛固酮节律变化与血压节律变化之间的关系。（4）通过灌胃（100mg/kg/d，共7天）或ICV注射（10μg/kg/d，共7天）的方式给予螺内酯，以分别全身或中枢阻断MR；（5）应用免疫荧光技术计数c-Fos阳性细胞数量，比较两组小鼠基础状态下下丘脑室旁核（paraventricularnucleus，PVN）和延髓腹外侧头端区（rostralventrolateralmedulla，RVLM）神经元的激活水平；（6）评价交感-副交感神经紧张性：记录小鼠清醒状态下的血压和HR，分别在两组小鼠腹腔注射胆碱能受体阻断剂阿托品（atropine，1mg/kg，i.p.）、肾上腺能受体阻断剂普萘洛尔（propanolol，1mg/kg，i.p.）和外周神经节阻断剂溴化六甲铵（hexamehtonium，5mg/kg，i.p.），比较两组动物动脉血压和心率变化的不同，以间接评估交感和副交感传出活动的变化；（7）评价动脉压力感受器反射：静脉注射苯肾上腺素（PE，10、20、40μg/kg）和硝普钠（SNP，30、60、120μg/kg）急性升高或降低血压，诱发心动过缓或心动过速反应，用HR的变化与SBP的变化比值（ΔHR/ΔSBP，压力感受器反射增益）表示压力感受器反射敏感性，比较两组小鼠压力感受器反射功能差异；（8）单细胞PCR技术分析目的基因的表达。 结果： 1.TASK-/-小鼠24h每个时间点的SBP和DBP都较TASK+/+小鼠高，24h平均SBP与DBP也都较TASK+/+小鼠高。TASK-/-小鼠HR只在部分时间段（23:00~3:00）较TASK+/+小鼠高，而两组小鼠的24h平均HR无显著差异。 2.TASK-/-小鼠表现为高醛固酮血症、高血钠、低血钾，其血浆醛固酮浓度在6:00、12:00、18:00、24:00各时间点都显著高于TASK+/+小鼠。 3.两组小鼠血压与血浆醛固酮浓度均存在昼夜节律，虽然两组小鼠血浆醛固酮浓度与血压昼夜节律并非平行关系，但TASK-/-小鼠白天和夜间SBP、DBP与血浆醛固酮浓度都较TASK+/+小鼠显著升高。 4.全身或中枢阻断MR后，TASK+/+小鼠的24h平均SBP、DBP、HR均无显著变化，而TASK-/-小鼠的24h平均SBP、DBP均显著降低，而HR无显著变化。 5.腹腔注射阿托品后两组小鼠HR均升高，而HR变化幅度无显著差异，提示TASK通道敲除后对副交感神经系统紧张性无显著影响。 6.腹腔注射普萘洛尔后两组小鼠HR均降低，TASK-/-小鼠HR降低幅度显著大于TASK+/+小鼠；全身或中枢阻断MR后，TASK-/-小鼠普萘洛尔诱导的HR降低幅度较给药前均显著减小，提示TASK-/-小鼠交感神经紧张性呈MR依赖性增强。 7.腹腔注射溴化六甲铵后，两组小鼠平均动脉压（MAP）均降低，TASK-/-小鼠MAP降低幅度显著大于TASK+/+小鼠；全身或中枢阻断MR后，TASK-/-小鼠溴化六甲铵诱导的MAP降低幅度较给药前均显著减小，提示TASK-/-小鼠交感缩血管神经紧张性呈MR依赖性增强。 8.静脉注射PE引起TASK-/-小鼠（Arterialbloodpressure,ABP）升高的幅度和HR降低的幅度均较TASK+/+小鼠明显，而这种效应可被全身或中枢阻断MR消除，说明TASK-/-小鼠呈MR依赖性的升压反应增强、心动过缓反应的钝化。 9.静脉注射SNP引起两组小鼠ABP下降的幅度无差异，而TASK-/-小鼠反射性HR升高的幅度在大剂量时较TASK+/+小鼠降低。 10.与TASK+/+小鼠相比，TASK-/-小鼠PE诱导的心动过缓增益减少，全身或中枢螺内酯处理能改善TASK-/-小鼠心动过缓反射增益；而SNP诱导的心动过速增益在两组之间无显著性差异。因此，TASK-/-小鼠表现为MR依赖的压力感受器反射功能抑制。 11.NTS中有同时表达MR与11β-HSD2的细胞，是醛固酮靶向神经元。免疫荧光结果显示，TASK-/-小鼠PVN、RVLM中c-Fos阳性细胞数量较TASK+/+小鼠显著增多，说明基础状态下激活的TASK-/-小鼠交感神经节前控制神经元增多。 12.敲低TASK+/+小鼠NTS的MR可抑制压力感受器反射；相反，敲低TASK-/-小鼠NTS的MR可改善压力感受器反射的抑制。因此，NTS的MR信号系统在调节压力感受器反射中发挥着重要作用。 结论：TASK-/-小鼠具备PA的临床表型，是较理性的PA动物模型；MR依赖性的交感神经紧张性增加和动脉压力感受器反射钝化是TASK-/-小鼠高血压形成的主要机制之一，同时NTS的醛固酮-MR信号系统功能紊乱参与了动脉压力感受器反射的抑制。
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