摘要
研究背景：心脏淋巴管生成和完整性在维持心肌组织液平衡中起着重要的作用。淋巴管生成障碍与心肌缺血性损伤及压力超负荷引起的心脏水肿和重构密切相关。然而，淋巴管生成和完整性在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心脏重构中的作用及机制仍不清楚。 研究目的：明确在AngⅡ诱导的小鼠心脏重构过程中淋巴管生成和通透性的改变情况；阐明淋巴管生成和通透性改变调控心脏重构的分子机制，为临床上心脏重构的防治提供新药靶点和新措施。 研究方法： 1．实验动物模型的建立和处理 本研究以野生型C57BL/6J(WT)小鼠、淋巴内皮特异性VEGFR-3基因敲除(VEGFR-3f/-)小鼠及同窝对照(VEGFR-3f/f)小鼠为研究对象，应用AngⅡ(1000ng/kg/min)灌注小鼠3、7和14天诱导小鼠心脏重构模型。同时，腹腔注射蛋白酶体抑制剂环氧霉素(Epoxomicin，0.58mg/kg/day)并持续至14天，探讨蛋白酶体活性在AngⅡ诱导的心脏重构中的作用。 2．小鼠血压和心功能的监测 采用尾套法(Tail-cuff)监测小鼠基础血压和AngⅡ灌注不同时间点的血压；采用M-型超声心动图谱分析各组小鼠心脏收缩及舒张功能，检测参数包括：射血分数(EF%)、短轴缩短率(FS%)、左室前壁及后壁的厚度(IVAW，LVPW)，左室内径(LVID)等。 3．小鼠心脏水含量的测定 应用干湿重的方法检测各组小鼠心脏水含量，计算公式为：小鼠心脏水含量(%)=（心湿重-干重）／湿重×100%。 4．组织病理学观察 心脏组织切片进行以下染色：苏木素-伊红(H＆E)、马松三色(Masson)、免疫组织化学(IHC)、小麦胚芽凝集素(WGA)、二氢乙锭(DHE)及免疫荧光染色(IF)等。 5．淋巴管通透性的测定 动物：将20μl伊文斯兰注射于小鼠足垫内，16小时后取出小鼠腘窝淋巴结，研磨后，应用酶标仪在620nm下，测定其吸光度(OD)值。体外淋巴管内皮细胞(LECs)：分别用伊文思蓝和FITC-葡聚糖检测LECs的通透性。 6．蛋白酶体活性的测定 提取小鼠心脏组织及淋巴内皮细胞蛋白，加入荧光底物，在酶标仪中分别测定半胱氨酸氧蛋白酶、胰蛋白酶样及糜蛋白酶样的活性。 7．基因及蛋白表达的分析 应用实时荧光定量PCR检测各基因mRNA的水平。应用免疫印迹方法测定相关蛋白的表达水平。 8．统计学分析 本研究中的所有数据以均数±标准差表示。使用GraphPadPrism9软件进行统计学分析。首先，对所检测数据进行正态分布分析。若实验数据符合正态分布，则使用独立的t检验来确定两组之间的统计学差异；若数据不符合正态分布，则使用Mann-Whitney检验进行分析。采用单因素方差分析和双因素方差分析分析多组之间的差异。以P＜0.05表示具有统计学差异。 研究结果： 1．AngⅡ灌注促进血压升高、心脏重构以及淋巴管生成增加 AngⅡ灌注野生小鼠3、7和14天后，收缩压、心肌肥厚、纤维化、炎症反应、氧自由基水平、LYVE1+/VEGFR3+淋巴管数量、LYVE-1+淋巴管数量与心肌细胞数量的比值以及VEGF-C和VEGFR3水平均呈时间依赖性增高。 2．AngⅡ灌注促进心脏淋巴管通透性增高和心脏水肿 AngⅡ灌注野生小鼠3天、7天和14天后，与盐水组相比，淋巴管通透性（用腘窝淋巴结OD值表示）及其相关蛋白信号蛋白p38MAPK呈时间依赖性升高；而淋巴管通透性负性调节蛋白MKP5和VE-cadherin的表达水平呈时间依赖性降低。另外，心肌组织的含水量(%)也呈时间依赖性增高。 3．VEGFR-3基因敲除抑制AngⅡ诱导的心脏淋巴管生成，加重心脏水肿、重构和功能障碍 AngⅡ灌注后14天后，与VEGFR3f/f对照小鼠比较，VEGFR-3敲除组小鼠的收缩血压明显升高，心脏淋巴管生成（用LYVE1+/VEGFR3+淋巴管数量、LYVE-1+淋巴管数量与心肌细胞数量的比值及VEGFR3/ERK1/2/AKT表达量表示）明显降低。同时，心脏重构程度（包括心肌肥厚、纤维化、氧自由基产生和CD68+巨噬细胞数量）及其相关信号通路和心功能能障碍在VEGFR-3敲低小鼠进一步加重。 4．AngⅡ促进蛋白酶体活性和淋巴管内皮细胞通透性增高 与盐水组相比，AngⅡ灌注14天后明显升高心脏组织的蛋白酶体的胰蛋白酶样和糜蛋白酶样的活性以及催化亚基(β2i、β5i)的表达水平。体外实验也发现，AngⅡ处理后可显著升高淋巴管内皮细胞(LECs)中胰蛋白酶样和糜蛋白酶样的活性以及β2i和β5i的表达水平。同时，AngⅡ激活LECs中p38MAPK，而降低MKP5和VE-cadherin的蛋白水平。 5．体外应用蛋白酶体抑制剂环氧霉素处理减轻淋巴管内皮细胞的通透性 与对照处理组相比，AngⅡ引起的LECs通透性（用伊文思蓝和FITC-葡聚糖检测）增高和VE-cadherin荧光强度的降低完全被氯沙坦(AT1R抑制剂)或环氧霉素逆转。同时，氯沙坦或环氧霉素也可显著逆转AngⅡ引起的p38MAPK激活和MKP5和VE-cadherin的降低。 6．给予环氧霉素处理小鼠减轻心脏水肿，改善心脏重构和心功能障碍 与对照盐水组比较，环氧霉素处理小鼠后可明显降低AngⅡ引起的蛋白酶体活性和血压升高，减轻AngⅡ引起的心脏水肿程度，改善AngⅡ引起的淋巴管通透性增高（降低p38MAPK活性，升高MKP5和VE-cadherin水平）和抑制心脏重构程度（包括心肌肥厚、纤维化、氧自由基产生和CD68+巨噬细胞数量）以及改善心功能障碍。 研究结论： 本研究发现心脏淋巴管生成和淋巴屏障通透性增高均参与了AngⅡ诱导的心脏水肿和重构。AngⅡ通过MKP5/p38MAPK/VE-cadherin信号通路诱导LECs通透性增高，进而加重心脏水肿、重构和功能障碍。因此，选择性刺激淋巴管生成或抑制蛋白酶体活性可能是治疗高血压心脏重构的新策略。但仍需要进一步研究MKP5/p38MAPK/VE-cadherin信号在高盐饮食或压力超负荷引起的心脏重构中的作用。
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