摘要
近年来，随着健康食品概念的发展，人们对食品安全的重视程度越来越高。而真菌毒素污染在粮油食品中的大规模出现，使得针对真菌毒素的快速与高灵敏检测方法的开发成为检测人员的研究重点。大部分真菌毒素由于具有较高的化学稳定性和热稳定性，因此在一般的生产加工过程中难以去除。而摄入被真菌毒素污染的粮油食品，极有可能对人体产生致癌、致畸、致突变等不良影响。针对大部分真菌毒素具有污染范围广、去除难、危害大、限量低等特点，设计开发针对真菌毒素的快速便捷、高稳定性、高灵敏度的检测方法具有十分迫切的实际意义。本文设计了几种新型分析检测方法，用于对粮食样品中的真菌毒素进行快速、准确和高灵敏的检测： （1）在第三章工作中，使用Fe3O4空间网络结构结合磁性三相单滴微萃取技术对黄曲霉毒素B1（AFB1）进行了高灵敏检测。首先在磁性纳米材料上分别耦联AFB1的特异性抗体和抗原形成捕获探针和检测探针，在AFB1存在情况下，通过抗原抗体与目标物之间的竞争/亲和作用形成组装程度与AFB1浓度呈负相关的Fe3O4空间网络结构，利用磁性三相单滴微萃取技术提取所形成的Fe3O4空间网络结构，利用其类过氧化物酶催化作用，使3,3'',5,5''-四甲基联苯胺（TMB）发生氧化反应，以吸光值为检测信号实现对AFB1含量的检测。本工作中所制备的Fe3O4空间网络结构具有比单独的磁性纳米材料更好的催化性能，能大幅提高检测效率；同时使用的磁性三相单滴微萃取技术可以对检测体系中Fe3O4空间网状结构与游离磁珠和样品提取液基质进行高效分离，达到净化富集的效果，大大提高检测灵敏度。工作中提出在一滴具有TMB的萃取液滴中进行催化反应，通过优化萃取液体积、分离时间、萃取液pH、反应时间得到最佳的反应条件。该方法对AFB1的最低检测限（LOD）为0.034pg/mL，线性范围为0.0001-1ng/mL。使用该方法对多种实际样品进行检测，检测结果证明该方法具有较好的实际应用价值。 （2）在第四章工作中，采用DNA酶（DNAzyme）剪切结合杂交链式反应（HCR）对玉米赤霉烯酮（ZEN）和AFB1同时进行高灵敏检测。本工作的特点为：1、磁性纳米材料作为基底可用于目标物的分离富集净化；2、磁性纳米材料表面修饰了具有高度特异性识别能力的适配体，可实现对两种真菌毒素同时识别捕获；3、ZEN与AFB1的检测信号分别由酶循环剪切释放DNA链上的荧光团与链式反应形成的G-四链体增强硫代黄素T的荧光信号来产生，锌离子依赖性DNA酶（Zn-Enz）循环剪切技术与HCR技术结合可循环放大真菌毒素检测信号，大大提高检测灵敏度。在最佳实验条件下，该检测方法对ZEN和AFB1的线性范围分别为0.01-100ng/mL和0.01-250ng/mL，LOD分别为0.0032ng/mL和0.0085ng/mL。 （3）在第五章工作中，采用DNA模板制备Cu纳米粒子（CuNPs），结合HCR对ZEN、AFB1，赭曲霉毒素（OTA）三种真菌毒素同时进行高灵敏检测。目标真菌毒素适配体发夹链在捕获目标物后与P发夹探针形成双链结构，并被ExonucleaseⅢ酶循环剪切释放探针O，进而组装DNA四边形结构并引发两个HCR发生。通过DNA模板法在DNA四边形结构上制备的CuNPS与两个HCR反应分别释放三种荧光信号，实现三种目标物同时检测。在工作中使用Fe3O4@材料对体系中未完全反应的单链、双链DNA进行吸附与磁分离，避免猝灭基团使用，从而降低背景信号。该分析方法对三种真菌毒素（ZEN、AFB1和OTA）的LOD分别为0.008ng/mL、0.003ng/mL和0.006ng/mL，线性范围分别为0.01-100ng/mL、0.01-100ng/mL和0.01-50ng/mL。
NETL