摘要
肌萎缩侧索硬化症（amyotrophiclateralsclerosis,ALS）是一种罕见的神经系统退行性疾病，其特征是大脑运动皮层的上运动神经元及脑干运动神经核、脊髓前角的下运动神经元变性、丢失，导致进行性加重的肌萎缩、肌无力等。大约90%的ALS病例为散发性（sporadicALS,sALS），10%为家族性（familialALS,fALS）。其中，约有20%fALS和5%sALS的发病与Cu/Zn超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变有关。ALS的发病机制尚不明确，许多分子及细胞机制参与运动神经元的变性死亡，比如蛋白质聚集、线粒体功能障碍、RNA加工和代谢障碍、神经营养因子缺乏和轴浆转运异常等。该病目前无有效治疗药物，美国FDA认证的利鲁唑及依达拉奉仅能有限的延长生存期、延缓病情进展，因此减少使用加重ALS病情进展的药物，探究发病机制、寻找新的治疗靶点十分必要。 他汀类药物作为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoenzymeA,HMG-CoA）还原酶的抑制剂，是甲羟戊酸（Mevalonate,MVA）通路中的关键限速酶，广泛应用于降低胆固醇和预防心脑血管疾病。由于他汀类药物在减少胆固醇合成的同时，抑制甲羟戊酸途径代谢产物香叶基香叶基焦磷酸盐（geranylgeranylpyrophosphate,GGPP）的合成,影响蛋白质异戊二烯基化修饰，包括Ras家族成员中的Rab7，导致其功能障碍，影响细胞的自噬功能。自噬对清除异常蛋白、维持神经元内稳态发挥重要作用，自噬异常参与了神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）、帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）及ALS的发病过程。以往研究显示ALS患者存在能量代谢异常，特别是血脂代谢异常，需要他汀类药物的治疗，然而针对他汀类药物对ALS影响的研究结果有争议。本研究组的前期研究发现辛伐他汀通过抑制类异戊二烯的合成、加重NSC34-hSOD1G93A细胞模型的自噬流障碍，导致NSC34-hSOD1G93A细胞损伤，而他汀对ALS动物模型影响的研究鲜见报道。 因此，在本研究中，我们收集了河北医科大学第二医院近年来收治的ALS患者的血脂及载脂蛋白的资料，分析初诊时相关指标代谢特点及与疾病的相关性。同时，通过辛伐他汀干预ALS动物及细胞模型，进一步观察辛伐他汀对ALS动物模型的影响，并对其机制进行了相关研究。 第一部分肌萎缩侧索硬化患者初诊时血脂、载脂蛋白与疾病相关性分析 目的：回顾性分析血脂、载脂蛋白在肌萎缩侧索硬化患者初诊的表达水平及与疾病的相关性。 方法：收集148例ALS患者和120例健康体检者的临床信息，分析不同亚组ALS患者血脂及载脂蛋白水平差异及影响因素，采用SPSS21.0进行统计。 结果： 1.ALS患者在疾病前期即存在脂代谢异常，表现为TG、LDL-C、LDL-C/HDL-C（P=0.020；P=0.042；P＜0.001）以及ApoB（P=0.041）水平升高，且男性患者明显。 2.血清LDL-C、LDL/HDL-C、ApoB（P=0.030；P=0.039；P=0.011）在以球麻痹为首发症状的ALS患者中水平较低。而诊断延迟时间、疾病进展率及ALSFRS-R评分对血脂、载脂蛋白相关指标均无影响。 小结：ALS患者在疾病前期即存在脂代谢异常，部分患者表现为血脂升高，有需要他汀类药物治疗的指征。 第二部分辛伐他汀加速SOD1G93A小鼠疾病进展、缩短生存期 目的：观察辛伐他汀对SOD1G93A小鼠行为学影响。 方法：采用购自美国Jackson实验室的转基因SOD1G93A小鼠为动物模型，通过PCR技术对半合子雌性小鼠进行基因分型，依据鉴定结果分为SODlG93A雌性小鼠和野生型（SODlWT）的同窝雌性小鼠配对研究。在小鼠63日龄时，实验组给予胃管内注入辛伐他汀，对照组给予胃管内注入溶媒羧甲基纤维素钠（18只/组）。SODlG93A雌性小鼠随机分为辛伐他汀组（G93A-Sim）和溶媒组（G93A-Con）。将雌性配对SODlWT小鼠分为WT-Sim组和WT-Con组。观察小鼠的表型变化：体重、rotarod试验、神经功能缺损评分、发病时间以及生存期。另取实验小鼠在干预至120日龄时，经4%多聚甲醛灌注固定取材（5只/组），通过NISSL染色、CHAT免疫荧光染色观察腰髓前角运动神经元数量变化，通过GFAP、Iba1免疫荧光染色观察腰髓胶质细胞的表达。 结果： 1.行为学：辛伐他汀加剧SODlG93A小鼠体重下降，加速疾病发生（97.33±2.77dvs100.72±2.32d），生存期缩短（127.22±3.37dvs135.61±3.40d），与对照组相比具有显著的统计学差异（P＜0.001）。 2.组织病理学：NISSL染色、CHAT免疫荧光染色结果显示，辛伐他汀加重SODlG93A小鼠腰髓前角运动神经元丢失，并伴随反应性星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba1）的激活，而对SODlWT小鼠没有明显影响。 小结：辛伐他汀加重SOD1G93A小鼠脊髓运动神经元丢失，提前发病时间，缩短SOD1G93A小鼠存活期。 第三部分辛伐他汀加重家族性ALS模型自噬流障碍 目的：观察辛伐他汀对fALS模型自噬流影响。 方法： 1.在体实验研究：采用购自美国Jackson实验室的转基因SOD1G93A小鼠为动物模型，通过PCR技术对半合子雌性小鼠进行基因分型，依据鉴定结果分为SODlG93A雌性小鼠和野生型（SODlWT）的同窝雌性小鼠配对研究。在小鼠63日龄时，实验组给予胃管内注入辛伐他汀，对照组给予胃管内注入溶媒羧甲基纤维素钠（5只/组）。SODlG93A雌性小鼠随机分为辛伐他汀组（G93A-Sim）和溶媒组（G93A-Con）。将雌性配对SODlWT小鼠分为WT-Sim组和WT-Con组。干预至120日龄时，经4%多聚甲醛灌注固定取材，通过免疫荧光染色分析腰髓P62、LC3、LAMP2、SOD1的表达变化；经快速新鲜取材提取腰髓蛋白，通过蛋白免疫印迹分析P62、LC3、SOD1蛋白的表达；经2.5%戊二醛溶液固定，应用透射电镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）技术观察腰髓前角运动神经元中自噬小体数量。另外，通过蛋白免疫印迹分析不同时期（90日、120日、终末期）P62、LC3、SOD1的表达水平。 2.体外实验研究：选取NSC34-hSOD1G93A稳转细胞作为细胞模型，应用辛伐他汀处理NSC34-hSOD1G93A细胞，通过免疫荧光染色分析P62、LC3、LAMP2、SOD1蛋白的表达水平。 结果： 1.SOD1蛋白异常聚集：通过免疫荧光、蛋白免疫印迹观察发现，SOD1G93A小鼠腰髓SOD1蛋白的表达水平增加，特别是辛伐他汀干预后显著升高。与G93A-Con组相比，G93A-Sim组小鼠腰髓神经元中表达大量SOD1+/P62+双阳性结构的自噬空泡。此外，药物干预后不同时段动态分析表明，G93A-Sim组腰髓SOD1蛋白水平，在120日及终末期均显著增加，而在90日时无统计学差异。 2.自噬观察：通过免疫荧光、蛋白免疫印迹观察发现，自噬标记物P62和LC3在SOD1G93A小鼠腰髓的表达高于SOD1WT小鼠，特别是G93A-Sim小鼠腰髓P62和LC3表达均较对照组G93A-Con明显升高，且P62、LC3的聚集经辛伐他汀长期干预而显著增加。而WT-Con和WT-Sim组间没有统计学差异。透射电镜观察显示，SODlG93A小鼠腰髓前角运动神经元胞质中出现较多封闭的双膜结构即自噬小体（APs），辛伐他汀药物干预后APs数量显著增多。WT-Con和WT-Sim组间Aps数量无统计学差异。 3.自噬流不同阶段观察：在体免疫荧光染色显示，对比G93A-Con与G93A-Sim组间腰髓神经元中P62+/LC3+双阳性结构（表示自噬体形成）百分比无统计学差异。而LC3+/LAMP2+双阳性结构（表示自噬体成熟）的百分比显著下降。体外免疫荧光染色也显示出相同的结果，即辛伐他汀干预的NSC34-hSOD1G93A细胞中LC3+/LAMP2+双阳性结构百分比显著减少，而P62+/LC3+双阳性结构百分比在组间比较没有统计学差异。 小结： 1.SOD1G93A小鼠存在自噬流障碍。 2.辛伐他汀加重SOD1G93A小鼠自噬流损伤，增加SOD1蛋白聚集。 3.辛伐他汀影响fALS模型自噬-溶酶体的融合过程。 第四部分辛伐他汀通过影响Rab7异戊二烯化修饰加重家族性ALS模型自噬流障碍 目的：观察辛伐他汀加重fALS模型自噬障碍的机制。 方法： 1.在体实验研究：采用购自美国Jackson实验室的转基因SOD1G93A小鼠为动物模型，通过PCR技术对半合子雌性小鼠进行基因分型，依据鉴定结果分为SODlG93A雌性小鼠和野生型（SOD1WT）的同窝雌性小鼠配对研究。在小鼠63日龄时，实验组给予胃管内注入辛伐他汀,对照组给予胃管内注入溶媒羧甲基纤维素钠（5只/组）。SODlG93A雌性小鼠随机分为辛伐他汀组（G93A-Sim）和溶媒组（G93A-Con）。将雌性配对SOD1WT小鼠分为WT-Sim组和WT-Con组。干预至120日龄时，经4%多聚甲醛灌注固定取材，通过免疫荧光染色分别观察Rab7在腰髓神经元（NeuN）和胶质细胞（GFAP、Iba1）中的表达；经快速新鲜取材提取腰髓蛋白，通过蛋白免疫印迹分析Rab7以及甲羟戊酸途径中关键酶HMG-CoA还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoenzymeAreductase,HMGCR）、法尼基二磷酸合成酶（farnesyldiphosphatesynthase,FDPS）和Rab香叶烯基转移酶（Rabgeranylgeranyl-Transferase,RABBGGTA）的蛋白水平。 2.体外实验研究：选取NSC34-hSOD1G93A稳转细胞作为细胞模型，应用辛伐他汀单独或联合类异戊二烯法尼基焦磷酸盐（FPP）、香叶基香叶基焦磷酸盐（GGPP）、CID1067700（CID,Rab7特异性抑制剂）处理NSC34-hSOD1G93A细胞及NSC34-E细胞。通过蛋白免疫印迹分析Rab7以及甲羟戊酸途径中关键酶HMGCR、FDPS和RABBGGTA表达水平；通过免疫荧光染色观察Rab7、LAMP2的表达变化。 结果： 1.Rab7蛋白观察：在体实验免疫荧光染色显示，辛伐他汀干预后G93A-Sim较G93A-Con腰髓神经元中Rab7阳性液泡样或点状结构表达数量减少了约50%，而WT-Con与WT-Sim组间比较无明显统计学差异。但是蛋白免疫印迹却显示SOD1G93A小鼠较SOD1WT小鼠腰髓的总Rab7蛋白水平升高，G93A-Sim与G93A-Con组间、WT-Con与WT-Sim组间未见差异。为解释这一矛盾，对Rab7与GFAP或Iba1进行共定位染色，结果显示与SOD1WT相比，SOD1G93A小鼠腰髓Rab7与GFAP或Iba1的共定位明显增加，特别是G93A-Sim组。而在SOD1WT小鼠腰髓可见Rab7主要在NeuN中表达。体外实验中观察Rab7膜定位情况。蛋白印记显示，各组间总Rab7蛋白水平无明显差异，辛伐他汀干预的NSC34-hSOD1G93A细胞，膜相关Rab7比例明显降低，胞浆Rab7蛋白比例明显升高，而在NSC34-E细胞组间无明显差异。同样，免疫荧光染色显示，辛伐他汀干预的NSC34-hSOD1G93A细胞内几乎看不到Rab7液泡样阳性结构，而是弥散表达在整个胞浆中，在NSC34-E细胞组间Rab7的表达未见差异。 2.MVA通路观察：在体实验蛋白免疫印迹分析显示，G93A-Sim组小鼠腰髓蛋白中，HMGCR、FDP及RABBGGTA表达水平较对照组均明显降低。体外实验NSC34-hSOD1G93A细胞也表现出类似结果。而辛伐他汀只适度降低了SOD1WT小鼠和NSC34-E细胞中HMGCR水平，不影响FDPS和RABGGTA的表达。 3.类异戊二烯对自噬平衡的观察：体外实验显示，补充FPP或GGPP均可明显改善辛伐他汀诱导的NSC34-hSOD1G93A细胞自噬流损伤，减少P62和LC3聚集，明显上调LC3+/LAMP2+双阳性共定位百分比，减少SOD1蛋白积累，增加活性Rab7重新膜定位包括溶酶体膜。 4.CID1067700（CID）实验：为了进一步验证SOD1G93A模型中自噬障碍缘于Rab7的功能障碍，体外实验中应用CID联合GGPP、辛伐他汀干预NSC34-E和NSC34-hSOD1G93A细胞。免疫荧光染色显示，CID与GGPP联合干预改变了Rab7的活性表达，阻断自噬小体与溶酶体的融合和降解，导致P62和LC3的重新积累，对LC3和P62共定位没有影响。这与辛伐他汀单独干预诱导NSC34-hSOD1G93A细胞的表型相似。此外，Filipin染色显示，辛伐他汀对NSC34-E和NSC34-hSOD1G93A细胞的细胞内游离胆固醇均无影响。 小结：辛伐他汀通过降低Rab7的异戊二烯化修饰，加重fALS模型神经元自噬-溶酶体的融合障碍，进一步加重神经元损伤。 结论： 1.辛伐他汀加重家族性ALS动物模型的病情进展。 2.辛伐他汀通过抑制甲羟戊酸通路，导致GGPP合成减少，影响Rab7异戊二烯化修饰，加重家族性ALS模型的自噬流障碍。 3.部分ALS患者在疾病前期可存在脂代谢异常，表现为血脂升高，他汀类药物应用时需慎重。
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