摘要
肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤，对人类生命健康造成严重威胁，是世界范围内癌症相关死亡的主要原因。肺腺癌（lungadenocarcinoma，LAC）是最常见的病理亚型，约占所有肺癌相关死亡率的40%。尽管不断有新的治疗策略用于临床，但LAC的5年生存率仅为18%。晚期LAC预后不良的原因包括低诊断率、出现转移和缺乏有效的治疗靶点等。因此，寻找新的特异性和敏感性生物标志物和治疗靶点对LAC患者的有效治疗具有重要价值。环状核糖核酸（Circularribonucleicacid，circRNA）是一类新的内源性剪接RNA，20世纪70年代，在病毒中首次被发现，由于技术水平限制，当时普遍认为circRNA是pre-mRNA剪接过程中的附加产物，不具有生物学功能。目前已发现，circRNA可调控癌症进展。由于其共价闭合环结构没有5′-3′多聚腺苷酸化末端，具有抵抗外切酶活性的能力，并保持高度稳定，这表明它们有潜力作为癌症生物标志物和治疗靶点。越来越多的证据表明，circRNA在调节LAC发生发展过程中发挥着重要作用，拥有很好的稳定性、组织特异性和物种保守性，有望为LAC的诊断、治疗及预后分析提供新手段。 本研究通过分析GEO（geneexpressionomnibus）数据库发现，与配对的相邻非癌组织相比，有三种circRNA在LAC组织中高表达。回顾性临床研究显示，这三种circRNA表达水平越高，LAC患者预后越差。为了揭示这些circRNA潜在的生物学机制，我们对其靶向微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）和可能影响的下游信使核糖核酸（MessengerRNA，mRNA）进行筛选，构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络。随后建立了一个蛋白质与蛋白质相互作用（Proteinproteininteraction，PPI）网络，最终确定了六个枢纽基因。使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库进行的回顾性研究显示，每个枢纽基因表达水平高与LAC患者较差的总生存期相关。这些发现揭示了一些新的circRNA可能在LAC病理生理学中发挥重要作用。此外，通过对circRNA-miRNA-mRNA网络调控LAC进展的分子机制研究，揭示hsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088和hsa_circ_000166有可能成为LAC的生物标志物和治疗靶点。 第一部分肺腺癌及癌旁组织中差异表达环状RNA分析研究 目的：通过基因数据库数据筛选LAC患者癌及癌旁组织中差异表达circRNA，结合临床数据分析，探究潜在circRNA在LAC发生及发展中的作用。 方法： 1.通过limmapackage对GEO中数据集GSE101586进行分析，获得LAC组织与其对应癌旁组织中差异表达的circRNA谱图。 2.选择潜在circRNA，利用逆转录-定量PCR（RT-qPCR）验证这些circRNA在LAC组织中表达情况。 3.通过Sanger测序法鉴定潜在circRNA的PCR产物序列，RNaseR处理三种circRNA，验证潜在circRNA的环化性质。回顾性分析临床资料揭示这些circRNA在LAC发生及发展中作用。 结果： 1.用limmapackage对GEO中GSE101586数据集进行分析，与癌旁组织相比，LAC组织中共有47个上调的circRNA和21个下调的circRNA。在设定标准后，筛选出在LAC组织中显著上调的四种circRNAhsa_circ_0043278，hsa_circ_0006220，hsa_circ_0072088，hsa_circ_0001666。 2.经RT-qPCR证实circRNAhsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088、hsa_circ_0001666在LAC组织中表达上调。 3.经过基因测序验证了三种circRNA的剪切环化位点序列。 4.这三种circRNA都对RNaseR具有抗性，而对应的线性形式在RNaseR处理后的水平显著降低。验证了三种circRNA的环化性质。 5.三种circRNA表达水平高与LAC患者预后差相关。 小结：hsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088和hsa_circ_0001666 在LAC中表达较癌旁组织高且表达稳定。三种circRNA的表达水平越高，LAC患者预后越差。 第二部分不同环状RNA对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的分析研究 目的：通过体外实验，观察hsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088和hsa_circ_0001666对LAC细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法： 1.LAC细胞培养。 2.siRNA转染LAC细胞。 3.细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(MCE)检测LAC细胞增殖。 4.Transwell和Matrigel实验检测LAC细胞迁移和侵袭。 结果： 1.CCK-8实验检测显示si-hsa_circ_0006220、si-hsa_circ_0072088和si-hsa_circ_0001666转染后LAC细胞增殖能力减低。（P＜0.05） 2.Transwell和Matrigel实验检测结果显示si-hsa_circ_0006220、si-hsa_circ_0072088和si-hsa_circ_0001666转染后LAC细胞迁移和侵袭能力减低。（P＜0.05） 小结：si-hsa_circ_0006220、si-hsa_circ_0072088和si-hsa_circ_0001666介导的circRNA敲除可以抑制LAC细胞增殖、迁移和侵袭。三种circRNA在LAC细胞中可能具有致癌作用。 第三部分环状RNA调控肺腺癌进展的生物学机制研究 目的：研究circRNA潜在的生物学作用，揭示circRNA在LAC发生发展中的分子调控机制。 方法： 1.使用CircInteractome数据库筛选circRNA潜在靶miRNA。利用miRWalk软件筛选靶miRNA可能影响的下游mRNA，从TCGA数据库获得LAC中表达上调的mRNA。 2.对筛选重叠的mRNA分析，利用CytoHubbaplugininCytoscape筛选枢纽基因，构建circRNA-miRNA-hubgene亚网络。 3.建立蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库研究每个枢纽基因表达水平与LAC患者总生存期关系。 4.LAC组织制备病理切片，对60例LAC标本进行免疫组化来分析验证研究结果。 结果： 1.使用CircInteractome数据库以评分百分位≥98为标准，筛选出circRNA潜在靶miRNA(miR-520f、miR-1261、miR-1270、miR-620、miR-188-3p、miR-516b、miR-940和miR-661)，预测出miRNA的结合位点。 2.从miRWalk数据库中获得上述8个miRNAs的7829个靶基因。并从TCGA中获得了795个LAC上调基因。分析7829个靶基因和795个上调基因重叠部分，发现232个可能在LAC中发挥关键作用的靶基因。 3.构建circRNA-miRNA-mRNA网络,构建PPI网络，Cytoscape中的CytoHubba插件分析PPI网络,确定了6个枢纽基因：KIF2C,KIF18B,MELK,BIRC5,PLK1和CKAP2L。 4.GEPIA数据库分析显示这6个枢纽基因在LAC组织中的表达水平明显高于正常组织。每个枢纽基因高水平表达与患者较差的总生存率相关，所有这6个枢纽基因都显示出可能在LAC中发挥重要作用。 5.Cytoscape3.7.1构建circRNA-miRNA-枢纽基因调控网络，推测出三种circRNA在LAC进展中的分子调控机制，hsa_circ_0006220/hsa-mir-520f/KIF2C,hsa_circ__0001666/hsa-mir-940/KIF18B,hsa_circ__0001666/hsa-mir-940/CKAP2L,hsa_circ__0001666/hsa-mir-661/CKAP2L,hsa_circ__0001666/hsa-mir-188-3p/PLK1,hsa_circ__0072088/hsa-miR-1270/MELK,hsa_circ__0072088-hsa-miR-1261-BIRC5。 6.LAC组织免疫组化显示，KIF2C、KIF18B、MELK、BIRC5、PLK1和CKAP2L的高水平表达与LAC患者生存期较差相关，hsa_circ_0006220的表达与KIF2C的表达呈正相关，hsa_circ__0001666的表达与KIF18B、PLK1和的CKAP2L表达呈正相关。hsa_circ__0072088的表达与MELK和BIRC5的表达呈正相关。实验结果对hsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088、hsa_circ_000166可能作为miRNA海绵，调控miRNA发挥竞争性抑制其下游靶向mRNA表达的调控机制予以了验证。 小结：hsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088和hsa_circ_0001666可能通过调控KIF2C,KIF18B,MELK,BIRC5,PLK1和CKAP2L的表达而发挥致癌作用。 结论： 1.三种环状RNAhsa_circ_0006220、hsa_circ_0072088、hsa_circ_0001666在LAC组织中高表达，且与患者的不良预后相关，可作为LAC潜在的生物标志物和治疗靶点。 2.三种circRNA促进LAC的增殖、侵袭和迁移。 3.三种circRNA可作为miRNA的分子海绵，调控miRNA下游的关键靶mRNA，对肺腺癌细胞的功能发挥调控作用。
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