摘要
全球每天有上万人饱受癌症折磨，癌症是当前人类健康最大的威胁，同时也是当今医学与科学界亟需攻克的难题。由于发病早期的隐蔽性，多数癌症发现即为中晚期，阻碍了疾病的治疗、给患者家庭带来了极大的精神负担和物质负担。目前癌症的早期诊断主要通过对癌症标志物进行检测，但是多数癌症标志物含量较少，且检测单个癌症标志物不能明确判断疾病的种类，传统的检测方法在检测癌症标志物时有着很大局限性。因此，开发高灵敏度、高特异性、通用的新型快速检测方法对疾病预防以及早期诊断有重要意义。CRISPR/Cas系统是生物传感领域新兴的识别和信号放大方法，其在灵敏度、特异性和反应速率方面具有显著优势。本论文主要利用CRISPR/Cas系统的激活特点，设计了不同的激活方式，从而实现对三磷酸腺苷（ATP）、谷胱甘肽（GSH）、Fpg糖基化酶以及癌细胞外泌体表面蛋白的超灵敏检测。本论文的主要内容概括如下： 第一部分，构建了一种向导RNA（crRNA）回路用于激活CRISPR/Cas12a活性的通用型荧光生物传感器实现对ATP、GSH、Fpg糖基化酶的检测。通过设计三种crRNA锁，由不同的目标物解锁释放crRNA，最终激活Cas12a蛋白的反式切割活性，产生荧光。同时为了进一步扩展该通用型荧光生物传感器在生物运算中的应用，三种crRNA锁被用于构建逻辑门，对多种目标物进行同时检测。这种通用性荧光生物传感器的意义在于大大增加了检测的准确性，只需修改不同的适配体即可实现不同物质的检测，为CRISPR/Cas系统在荧光生物传感中的应用开辟了新思路。 第二部分，开发了一种基于CRISPR/Cas12a系统的外泌体表面蛋白图谱构建方法。通过适配体识别一种通用蛋白CD63和某种特异性细胞表面蛋白进行双绑定，起始催化发夹自组装反应（CHA）进而激活CRISPR/Cas12a-crRNA1的一级信号放大，同时释放被封闭的crRNA2，激活二级信号放大，由此构成协同增强的信号放大反应。这种协同增强反应比只存在一级信号放大的反应所需检测时间少，双绑定的方法减少背景信号，提高检测的准确性，同时为不同癌细胞的检测提供了参考方法。
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