摘要
目的： 本研究以体外培养的人肾小球内皮细胞(humanrenalglomerularendothelialcells,HRGECs)及人肾小球足细胞(humanglomerularpodocytes,HPCs)为研究对象，探讨糖尿病肾病时HRGECs外泌体源性miR-486-5p对HPCs损伤的影响及可能机制，为进一步探索糖尿病肾病(diabetickidneydisease,DKD)蛋白尿形成机制，寻求可能治疗靶点提供实验依据。 方法： 1.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体是否介导足细胞损伤 以体外培养的HRGECs及HPCs为研究对象，将HRGECs随机分为对照组(control,葡萄糖浓度为5mM)、高糖刺激组(highglucose,HG,葡萄糖浓度为30mM)、甘露醇组(mannitol,MA,甘露醇浓度为30mM)和TGF-β1刺激组(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1,TGF-β1浓度为20ng/ml)，培养48h，更换为正常HRGECs的ECM培养基继续培养24h：①取此培养上清与HPCs的培养基RPMI1640按照1:1的比例配制成条件培养基，以此条件培养基培养HPCs48h；②收集上清并提取外泌体，透射电镜及蛋白质免疫印迹(westernblot,WB)鉴定外泌体形态和检测特异性标记蛋白的表达，免疫荧光(immunofluorescence,IF)验证PKH67标记的外泌体是否可被HPCs摄取；③提取外泌体，以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs48h，收集各组HPCs，WB检测HPCs中nephrin和podocin蛋白表达水平。 2.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体中miR-486-5p是否参与介导足细胞损伤 ⑴以体外培养的HRGECs为研究对象，随机分为对照组、HG刺激组、MA组和TGF-β1刺激组，培养48h，更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24h，收集上清并提取外泌体，基因芯片技术筛选外泌体中差异表达的miRNA，实时荧光定量PCR(quantitativerealtimepolymerasechainreaction,realtimePCR)检测各组外泌体中miR-486-5p水平。 ⑵HRGECs随机分为对照组、HG组、MA组、HG+miR-486-5pinhibitor组、HG+NC组以及TGF-β1组、TGF-β1+miR-486-5pinhibitor组、TGF-β1+NC组，细胞融合至50%时进行转染，24h后加入HG及TGF-β1刺激48h，再更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24h，收集培养上清，提取外泌体，realtimePCR检测外泌体中miR-486-5p水平；以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs48h，realtimePCR检测HPCs中miR-486-5p水平，WB检测HPCs中nephrin、podocin蛋白表达水平。 3.检测DKD肾小球内皮细胞来源的外泌体中miR-486-5p是否通过调控PTEN/Akt信号通路，介导足细胞损伤 HRGECs随机分为control、HG、MA、HG+miR-486-5pinhibitor、HG+NC、TGF-β1、TGF-β1+miR-486-5pinhibitor及TGF-β1+NC组，细胞融合至50%时进行转染，孵育24h后加入高糖及TGF-β1刺激48h，再更换为正常HRGECs培养基ECM继续培养24h，收集培养上清，提取外泌体，以30μg/ml浓度的外泌体刺激HPCs48h，WB检测HPCs中PTEN(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen)、p-Akt、Akt蛋白表达水平。 结果： 1.DKD时肾小球内皮细胞来源的外泌体可介导足细胞的损伤 ⑴WB结果显示，与对照组相比，高糖及TGF-β1刺激HRGECs后，其培养上清会造成HPCs中nephrin和podocin蛋白水平降低。 ⑵透射电镜结果显示，HRGECs上清提取物为圆形或椭圆形，具有双层膜结构，直径为80-150nm，符合外泌体形态特征；WB结果证实外泌体提取成功。IF结果显示，高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体可被HPCs摄取；且高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体可引起HPCs中nephrin和podocin蛋白水平降低。 2.DKD时肾小球内皮细胞来源的外泌体中miR-486-5p水平升高，进而引起足细胞损伤 ⑴提取外泌体，基因芯片技术筛选差异表达的miRNA，显示miR-486-5p水平升高。RealtimePCR验证高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体miR-486-5p水平升高，并且以此外泌体刺激HPCs，与对照组相比，足细胞中miR-486-5p水平明显升高。 ⑵RealtimePCR结果显示，在HRGECs中敲低miR-486-5p后给予高糖或TGF-β1刺激，其所分泌的外泌体中miR-486-5p水平下降，以此外泌体刺激HPCs，与HG+NC-exo组或TGF-β1+NC-exo组相比，HG+miR-486-5pinhibitor-exo和TGF-β1+miR-486-5pinhibitor-exo组足细胞中miR-486-5p水平有所下降，nephrin和podocin蛋白升高。 3.肾小球内皮细胞来源性外泌体中的miR-486-5p通过调控PTEN/Akt信号通路，介导DKD时足细胞损伤 WB结果显示，高糖及TGF-β1刺激HRGECs所分泌的外泌体会引起HPCs中PTEN蛋白表达水平降低，p-Akt-Ser473蛋白表达明显增加，而敲低HRGECs中的miR-486-5p后，外泌体可引起HPCs中PTEN表达上调，p-Akt-Ser473水平下降。 结论： 在糖尿病肾病时，肾小球内皮细胞以外泌体形式分泌miR-486-5p，通过激活PTEN/Akt信号通路介导足细胞损伤。
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