摘要
柠檬烯是一种重要的植物天然产物，广泛应用于食品、化妆品生产以及医药、化工等行业。然而，植物提取效率低，化学合成能耗高，限制了柠檬烯工业生产的可持续性。近十年来，微生物代谢工程和合成生物学的迅速发展，使一系列生物产品的可持续生产成为了可能。但柠檬烯对底盘细胞具有较高的毒性，抑制了其大规模工业微生物制造的发展。因此，缓解柠檬烯的细胞毒性，增强微生物细胞工厂的稳健性是柠檬烯工业化生产的迫切需要。 本研究以解脂耶氏酵母为对象，研究了柠檬烯胁迫对解脂耶氏酵母生理活动的影响，以提高解脂耶氏酵母对柠檬烯的耐受性和产量。首先，通过转录组学比较分析，选择了82个经柠檬烯胁迫后表达量上调的基因，将这些基因分别在解脂耶氏酵母中过表达。其中，8个候选基因的过表达提高了对柠檬烯的耐受性。为了确定这些基因是否也可以提高柠檬烯的产量，分别将赋予柠檬烯耐受性的基因与柠檬烯生产途径基因共表达。数据表明，8个赋予柠檬烯耐受性基因中的5个能够提高柠檬烯的产量，未知基因YALI0F19492g的过表达使柠檬烯的产量提高了8倍。之后，从解脂耶氏酵母中将YALI0F19492g基因敲除，结果显示，柠檬烯的产量降低了45%。结合该实验结果和生物信息学预测的结果，推测YALI0F19492p可能是一个转运蛋白，可用于改善柠檬烯的生产。据了解，本研究首次阐述了YALI0F19492g基因的功能，在此之前，尚未有人报道。 转运蛋白能够对多种物质进行转运，并排除相关生物毒素，起到保护细胞的作用。本研究在解脂耶氏酵母中分别异源表达了来自大肠杆菌的转运蛋白AcrB和来自罗汉果的转运蛋白ABC‐G1。结果表明，ABC‐G1的表达显著缓解了柠檬烯对酵母工程菌株的细胞毒性，提高了菌株的耐受性，但对柠檬烯的产量没有明显的提升。而AcrB的表达对提高解脂耶氏酵母的柠檬烯耐受性和产量均无明显的帮助。 基于上述基因对柠檬烯的耐受机制，本实验研究了这些基因对其他萜类物质耐受性的影响(芳樟醇、(+)-诺卡酮和β-紫罗酮)。结果显示，除PHC基因之外，其他基因在芳樟醇/(+)-诺卡酮的胁迫下具有和柠檬烯相似的耐受性。而在β-紫罗酮的胁迫下，只有AcrB和ABC‐G1的过表达能够明显改善工程菌株的生长。 适应性实验室进化可以有效地提高微生物对抑制剂的耐受性。为了探索适应性实验室进化对解脂耶氏酵母的柠檬烯耐受性和产量的影响，本研究将酵母菌株暴露在不用浓度的柠檬烯胁迫环境下，进行短期连续传代培养。研究表明，柠檬烯的毒性抑制机制能够引起细胞膜/壁的损伤，不同应激源水平和适应过程的短期适应策略导致酵母细胞结构对柠檬烯产生不同的应激反应，最优的短期适应性实验室进化策略可以将柠檬烯的产量提高52%。 本研究为提高宿主菌株对柠檬烯的耐受性和产量提供了有价值的参考，并从分子水平和细胞水平阐释了柠檬烯的毒性机制。结果表明，将组学工程，耐受性工程，合成生物学和进化工程相结合是缓解柠檬烯细胞毒性、增强微生物细胞工厂稳健性的可行策略。
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