摘要
目的：本研究通过构建环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DiethylhexylPhthalate,DEHP）孕期暴露模型，明确DEHP对仔代睾丸的发育损伤作用。结合单细胞测序技术，全面评估DEHP孕期暴露对仔代生殖细胞发育的毒性损伤作用及其潜在机制。通过体外实验进一步证实ROS介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路在生殖母细胞发育过程中的损伤作用。本研究为防治环境内分泌干扰物DEHP所致发育毒性和生殖毒性提供科学数据，也为早期生育力保护策略提供科学依据。 方法：第一部分：采用750mg/kgb.w.剂量DEHP对Sprague-Dawley（SD）孕鼠从孕13天（Gestationday，GD）灌胃至出生，构建DEHP孕期暴露动物模型：（1）观测生后第1天（postnatalday1,PND1）、PND3、PND6、PND9仔鼠体重、睾丸质量，采用苏木素-伊红染色（Hematoxylim-eosin,HE）检测睾丸组织病理学，采用蛋白免疫印迹实验（Westernblot,WB）检测睾丸组织内源性凋亡途径重要蛋白（Bax、Bcl-2、细胞色素C、Cleaved-Caspase3），生精标志物（Mvh、PLZF、c-Kit）蛋白表达水平。（2）通过WB对PND1、PND3、PND6、PND9仔代睾丸组织中氧化酶学指标(Nrf2、HO-1)及PI3K/Akt/mTOR信号通路重要蛋白（PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR）蛋白表达水平进行检测。 第二部分：采用750mg/kgb.w.剂量DEHP对C57孕鼠灌胃（GD13至出生），构建DEHP孕期暴露动物模型，利用单细胞测序技术全面、深入分析DEHP孕期暴露对仔代睾丸损伤潜在作用及相关机制。（1）将PND5仔代睾丸组织解离为单细胞悬液，质控合格后上机构建cDNA文库，对质控合格的数据进行数据定量、质控、细胞过滤后用于后续测序数据生信分析。（2）在无监督聚类下对细胞进行降维、聚类、可视化，得到23个细胞群，基于marker基因定义相应细胞群。（3）聚焦生殖细胞亚群，对生殖细胞亚群进行亚群定义、转录组差异分析、拟时序分析。（4）对支持细胞亚群进行转录组差异分析、细胞周期分析、拟时序分析。（5）对间质细胞亚群进行转录组差异分析。（6）对PTMs进行转录组差异分析、拟时序分析。（7）对仔代睾丸内细胞间通讯关系进行探讨。 第三部分：构建DEHP活性代谢产物邻苯二甲酸单-乙基己酯（Mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP）致小鼠畸胎瘤细胞系P19（生殖母细胞体外模型）损伤模型。（1）采用浓度梯度MEHP干预P19细胞，CCK8检测细胞存活率，明确MEHP对P19细胞的毒性损伤作用和MEHP体外干预浓度。（2）采用WB检测细胞内源性凋亡途径重要蛋白（Bax、Bcl-2、细胞色素C、Cleaved-Caspase3），采用WB、免疫荧光实验检测P19细胞干性标志物（Oct4、Sox2、Nanog）蛋白表达水平、细胞定位。（3）采用视黄酸（Retinoicacid,RA）诱导P19细胞，构建P19细胞向生殖细胞分化模型。采用流式细胞术检测细胞凋亡水平、细胞周期，确定适宜分化的RA浓度。采用WB、免疫荧光检测生殖细胞干性标志物（Oct4、Sox2、Nanog）和分化标志物（Stra8、c-Kit）蛋白表达、细胞定位情况。（4）采用MEHP与RA同时干预P19细胞，并通过WB、免疫荧光检测生殖细胞分化标志物（Stra8、c-Kit）蛋白表达、细胞定位情况。（5）检测P19细胞活性氧（ReactiveOxygenspecies,ROS）水平，采用WB检测氧化酶学指标（Nrf2、HO-1）、PI3K/Akt/mTOR信号通路重要蛋白（PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR）。（6）采用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）对MEHP400μM及RA+MEHP400μM组进行挽救实验。检测P19细胞内ROS水平、氧化应激损伤指标、PI3K/Akt/mTOR信号通路。 结果：第一部分：DEHP孕期暴露可致仔鼠体重、睾丸质量显著降低；睾丸组织病理学表现为仔代睾丸生殖母细胞迁移、分化障碍，出现多核巨核的畸形生殖母细胞。生精标志物Mvh、PLZF、c-Kit蛋白表达水平显著降低。内源性凋亡途径重要蛋白Bax/Bcl-2、细胞色素C、Cleaved-Caspase3表达水平明显上升。睾丸内氧化酶学指标Nrf2、HO-1表达水平显著上升,PI3K/Akt/mTOR信号通路重要蛋白PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著下降。 第二部分：通过marker基因将细胞定义为生殖细胞、支持细胞、间质细胞、管周肌样细胞（peritubularmyeloidcells,PTMs）、内皮细胞、基质细胞、巨噬细胞及淋巴细胞，并对每类细胞marker基因进行GO及KEGG富集分析。将生殖细胞进行亚群分析，分别定义为精原干细胞群SSC-1、精原祖细胞群SSC-2、分化型精原细胞Differentiated-SG；拟时序分析结果提示生殖细胞发育始于SSC-1，终止于Differentiated-SG，SSC-2为中间过渡态细胞；将细胞分化过程中随拟时间线变化最为显著的前50个差异基因按表达趋势分为三群，每群基因集在不同发育阶段生殖细胞中起优势作用。DEHP干预后，仔代睾丸内细胞组成发生明显变化，即生殖细胞数量减少，分布异常，发育轨迹异常，生殖细胞主要集中于SSC-1或state1。生殖细胞亚群差异基因主要富集于细胞分化负向调控、干细胞干性维持、氧化应激及P53介导的内源性凋亡途径等功能基因集。对支持细胞群进行亚群分析，DEHP干预后，支持细胞群数量减少，分布异常，发育轨迹异常，细胞周期阻滞。两组差异基因主要富集于细胞骨架、细胞黏附、细胞周期、氧化应激及P53介导的内源性凋亡途径等功能基因集。对间质细胞群进行两组间转录组差异分析，差异基因主要富集于线粒体、线粒体内膜、内质网、胆固醇代谢过程及氧化应激等功能基因集。对PTMs进行亚群分析，DEHP暴露后，PTMs细胞组成及发育轨迹差异明显，差异基因主要富集于缺氧、氧化应激、P53介导的内源性凋亡途径、雄性性腺发育及细胞连接等功能基因集。睾丸内细胞间通讯分析结果表明DEHP暴露后，细胞间受体-配体互作对数量及种类发生改变，其中DEHP组生殖细胞GDNF信号通路受体Gfra1、Ret表达水平上调，体细胞中TGF-β、Hedgehog信号通路配体BMP4、BMP2和Dhh表达水平下调。 第三部分：MEHP暴露引起P19细胞相对存活率下降。MEHP干预后，P19细胞内源性凋亡途径重要蛋白Bax/Bcl-2、细胞色素C、Cleaved-Caspase3表达水平明显上升；细胞干性标志物Oct4、Sox2、Nanog蛋白表达水平显著降低。4μMRA干预P19细胞24h，对P19细胞凋亡水平、细胞周期无明显影响，干性标志物Oct4、Sox2、Nanog表达水平明显下降，定位由细胞核向细胞质转移，生殖细胞分化标志物Stra8、c-Kit表达水平显著上升，定位无明显改变；MEHP与RA同时干预P19细胞后，P19细胞分化相关标志物（Stra8、c-Kit）表达水平较RA单独干预组显著下降，定位无明显变化。MEHP处理P19细胞后，ROS爆发，氧化酶学指标（Nrf2、HO-1）表达明显上升，PI3K/Akt/mTOR信号通路重要蛋白PI3K、p-AKt/Akt、p-mTOR/mTOR表达明显下降。NAC可清除P19细胞内ROS水平，改善氧化应激损伤，解除MEHP导致的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制，挽救内源性凋亡途径激活引起的细胞凋亡，恢复P19细胞干性与分化潜能。 结论：DEHP孕期暴露可致仔代睾丸发育损伤，主要表现为生殖母细胞和各级精原细胞发育异常。DEHP体内活性代谢产物MEHP可引起P19细胞凋亡水平增加、干性抑制、分化障碍，ROS介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制是相关异常过程的主要分子机制。
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