摘要
目的： 原代培养小鼠PASMCs，建立稳定的小鼠PASMCs培养技术。探讨Ang-(1-7)对低氧诱导小鼠PASMCs的影响，及PKCα、Akt信号分子在低氧诱导小鼠PASMCs中表达的影响。 方法： 1.选取C57BL/6J健康成年小鼠，自右心室向肺动脉灌注含铁粉的琼脂糖溶液，后将离体肺组织切碎，结合酶消化法和磁性分离法获取小鼠含铁肺动脉血管，置于二氧化碳培养箱中进行原代及传代培养。采用SMCs特异性α-SMA抗体对细胞进行免疫荧光染色鉴定。 2.将小鼠PASMCs置于低氧培养箱中低氧处理，使用Ang-(1-7)及Mas受体拮抗剂A779进行药物干预。实验分为六组：常氧组（Normoxia）、常氧+Ang-(1-7)组、低氧组（Hypoxia）、低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组。 3.CCK-8检测各实验组小鼠PASMCs增殖情况。免疫荧光、Western-blot检测各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化情况。 结果： 1.成功培养出原代小鼠PASMCs，并顺利传至第3代开展后续试验。经特异性α-SMA抗体免疫荧光染色鉴定显示约90%的细胞呈阳性表达。 2.CCK-8法检测各实验组PASMCs低氧培养24h、48h、72h后增殖情况。结果显示，低氧24h后，与常氧组相比，低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组细胞生存力明显提高；与低氧组比较，低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组生存力提高明显；低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组间比较无统计学差异。低氧48h、72h后，与常氧组相比各低氧处理组均显示细胞生存力下降。 3.免疫荧光定性分析各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化。结果显示：与常氧组相比，PKCα蛋白分子在低氧组、低氧+Ang-(1-7)组的表达降低，低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组的表达升高。而Akt蛋白分子在常氧组、常氧+Ang-(1-7)组、低氧组间表达无明显差异，在低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组表达有所升高。 4.采用免疫印迹技术定量分析各实验组PKCα、Akt蛋白分子表达变化。与常氧组比较，常氧+Ang-(1-7)组、低氧组、低氧+Ang-(1-7)组PKCα蛋白表达均降低，低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组表达升高；与低氧组相比，低氧+Ang-(1-7)+A779组及低氧+A779组表达显著升高，低氧+Ang-(1-7)组表达无统计学差异；低氧+Ang-(1-7)+A779组与低氧+A779组比较无统计差异。常氧组、常氧+Ang-(1-7)组和低氧组间Akt蛋白表达无统计学差异；与低氧组相比，低氧+Ang-(1-7)组、低氧+Ang-(1-7)+A779组和低氧+A779组Akt蛋白表达均升高；与低氧+Ang-(1-7)组比较Akt蛋白在低氧+Ang-(1-7)+A779组表达升高，同时发现低氧+A779组Akt蛋白表达比低氧+Ang-(1-7)+A779组增多。 结论： 1.通过酶消化法及磁性分离法结合，可稳定获取较高纯度的小鼠PASMCs。该方法利于获取小鼠远端肺小动脉，易操作，重复性高。 2.单纯低氧可能对体外培养原代PASMCs增殖无显著影响，且随着低氧时间的延长细胞可能出现明显的凋亡。抑制Ang-(1-7)特异性Mas受体可促进低氧环境下小鼠PASMCs增殖，该过程可能通过提高PKCα、Akt信号分子的表达实现；Ang-(1-7)可抑制该过程中Akt信号分子表达，但尚未发现对PKCα信号分子表达及细胞增殖的影响。
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