摘要
半乳糖苷化合物是一类广泛存在于动植物中参与多种生理功能的物质，具有多种生理活性，被广泛应用于食品、药品、保健品和日化用品领域中。其中半乳糖甘油酯和低聚半乳糖（GOS）都是具有广泛应用和高附加值的化合物。对于半乳糖甘油酯，其通过提取法制备，产物纯度低成本高。生产益生元GOS的方法主要是提取法和发酵法，提取法步骤繁琐，产率低，成本高，产量受到限制；发酵法收率低，成份复杂，分离纯化困难。因此使用条件温和、具有合成高区域选择性和立体选择性能力的酶法合成则是一个具有前景的发展方向。在本文中，我们利用来源于嗜热细菌的Thermotoga neapolitana RKU-10的β-葡萄糖苷酶Tn0602，构建了一种全新的体外合成半乳糖甘油酯的通路。使用廉价的底物乳糖和甘油，在Tn0602和脂肪酶联用下合成结构统一的半乳糖甘油酯。使用叔丁醇-水两相体系优化Tn0602催化乳糖和甘油的转糖苷反应合成中间体β-半乳糖基甘油的产量。在乳糖初始浓度1M，甘油初始浓度5M，30%水含量的体系中，Tn0602在12小时后达到416.9mmol/L的产量。中间体β-半乳糖基甘油纯化后在脂肪酶Novozym435的催化下与月桂酸进行酯化反应，成功合成单半乳糖基甘油单/双月桂酸酯。 已有研究证明Tn0602的另一个重要的应用是可以催化乳糖专一性地合成GOS3，为了探索其专一性合成GOS3的原因及获得更高聚合度的GOS，通过理性设计围绕GH1家族嗜热β-葡萄糖苷酶Tn0602的+2糖苷配基位点进行了合理设计和分子改造。以分子对接结果为基础，构建了六个围绕+2位点的单点突变体。75℃下，单点突变体F226G合成的产物是GOS3和GOS4的混合物，产率分别为32.0%和5.1%，同时与野生型相比，转糖苷活力提高10%，转糖苷/水解比提高2倍，突变体与GOS3的分子对接结果说明+2位点空间位阻和与糖苷配基的排斥作用影响了Tn0602催化产物的聚合度。 聚合度更高的GOS对调节肠道菌的发酵更有耐受力，从而在更远的肠道位置发挥益生元作用。在提高产物聚合度的基础上，提高Tn0602合成GOS的产率能够使其成为更有价值的工业用酶的候选酶。根据前期的研究，突变体F414S和F414Y（-1糖苷结合位点）相比于野生型具有更高的转糖苷活力。F226和F414两个位置之间的空间距离远，产生相互影响的可能性小，因此选择F226G分别与F414S和F414Y进行叠加，以获得最显著的叠加效应。因而，构建了+2/-1位点的叠加突变体F226G/F414S和F226G/F414Y，并探究了其合成GOS的活力。在75℃、pH6.5的环境下，F226G/F414S和F226G/F414Y合成的总GOS产量都超过F226G和野生型，反应12小时后F226G/F414S合成的GOS3产量为240.80mM，4小时后GOS4的产量为72.75mM，是迄今为止报道的最高产量。通过1D和2D NMR对产物结构的分析发现，Tn0602合成的GOS是既含有β（1→3）键也含有β（1→4）键的混合物。利用300ns的分子动力学模拟分析，发现单点突变F226G会导致+2位点具有更高的灵活性，+2位点的灵活性对产物聚合度产生重要影响。F226G/F414S具有稳定的酶-三糖中间体稳定性，这使其能够稳定高产地合成GOS3和GOS4。但由于Tn0602催化口袋的结构限制，即使减少了+2位点的空间位阻，依然未观察到GOS5的生成，这让用Tn0602单独生产高纯度GOS3和GOS4成为了可能。
NETL