摘要
小麦（Triticum aestivum L.）是重要粮食作物，中国小麦产区土壤有效磷的相对缺乏严重制约了小麦的可持续高产稳产。解析小麦磷调控基因网络，筛选鉴定耐磷胁迫基因，是小麦磷高效分子育种的重要基础，对实现小麦安全生产具有重要意义。 本实验室前期研究发现小麦TaSPX3基因受到磷胁迫的显著诱导表达。本研究克隆分析了TaSPX3基因cDNA全长序列，农杆菌转化法创制了过表达转基因小麦Fielder株系（TaSPX3-OE），以野生型Fielder小麦（WT）为对照，对其生理及分子功能进行了研究。主要结果如下： （1）TaSPX3-OE株系鉴定。在前期已经获得的T1代TaSPX3-OE小麦的基础上，对其进行扩繁并逐代进行分子检测筛选阳性株系，通过检测每代阳性株系TaSPX3的相对表达量，筛选出目的基因稳定高表达的阳性株，收取单株种子用于扩繁，鉴定获得9个T3代TaSPX3-OE株系。 （2）TaSPX3-OE缺磷水培处理下的生理表型检测。TaSPX3-OE以及野生型小麦WT在正常磷200μM（+P）和缺磷0μM（-P）水培条件下观察表型发现：在+P条件下，WT与TaSPX3-OE无显著生理表型差异；在-P7天条件下，TaSPX3-OE主根长度显著短于WT，且根鲜重显著升高，而地上部变化不明显。表明TaSPX3过表达在-P条件下造成小麦主根长度缩短，根鲜重增加，影响了根系的生长发育。 qRT-PCR结果显示：WT在-P处理下的TaSPX3相对表达量比+P处理有所增加，并且在这两种磷浓度处理条件下，TaSPX3-OE中TaSPX3相对表达量均高于野生型对照。除此之外，TaSPX3过表达也影响了缺磷条件下重要的磷饥饿响应（PSR）基因，如TaIPS1.1，以及磷酸转运蛋白TaPHT1.1/9、TaPHT1.10的转录水平，表明过表达TaSPX3在分子水平上能够对磷调控基因网络产生影响。 （3）转录组测序分析。选取TaSPX3-OE和WT小麦在-P处理7天条件下（存在生理表型差别）的材料进行转录组测序分析，根据TaSPX3-OE和WT在-P处理7天的表型差异对差异基因进行进一步的功能注释分析发现：相较于WT，TaSPX3-OE处理前后差异表达的基因无论是富集到通路的种类还是基因数量都显著减少；而根据KEGG注释分析，过表达TaSPX3会导致许多非生物胁迫相关的调控通路的改变，例如磷相关途径以及相关基因数量均减少。对其中相关激素通路进行分析，发现例如生长素、脱落酸以及乙烯等相关激素的下游调控基因都发生了显著下调（SAUR、PP2C、SnRK2、EBF1/2等），说明过表达TaSPX3抑制了部分磷相关和激素相关基因的表达。 （4）TaSPX3的亚细胞定位。将TaSPX3基因连接到带有YFP报告基因的pYFPLT载体上，构建融合表达载体并转化到小麦原生质体中，进行激光共聚焦亚细胞定位观察，发现TaSPX3-YFP可定位于细胞核与细胞质中。 （5）酵母双杂筛选TaSPX3互作靶标蛋白。构建小麦磷饥饿材料的酵母双杂文库，使用pGBKT7-TaSPX3融合表达载体构建诱饵蛋白，通过酵母双杂筛库实验，初步筛选出6个可能互作蛋白，分别是TraesCS5A02G326100.1（TaCP1）半胱氨酸蛋白酶，TraesCS2A02G381900.1（TaMYB2）MYB2转录因子，TraesCS4B02G087600.1（TaFBK），TraesCS7D02G412200.1（TaeIF4A）真核翻译起始因子4A，TraesCS7B02G249400.1（TaVIR），TraesCS1A02G395200.1（TaDI19）。以上候选互作蛋白，均能在非生物胁迫途径中发挥作用，为明确TaSPX3作用机制提供了线索。 （6）TaSPX3-RNAi材料的创制。将TaSPX3-RNAi载体通过农杆菌介导转基因技术转入到野生型小麦Fielder基因组中，创制TaSPX3-RNAi沉默表达材料。在DNA水平以及转录水平对获取的TaSPX3-RNAi材料进行检测，筛选出T0代以及T1代TaSPX3-RNAi株系12个，可用于后续试验研究。 本研究通过利用TaSPX3-OE材料对小麦磷胁迫调控基因TaSPX3进行了功能分析，结果表明，TaSPX3基因在磷胁迫条件下可以通过调控PSR等重要基因的表达，进而影响根的生长发育，参与植物响应磷胁迫的调控网络。本研究结果最终可为阐明TaSPX3在磷胁迫下发挥的功能及TaSPX3在磷信号调控网络中的作用机制供理论基础。
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