摘要
胆碱激酶(CK)基因在植物的生长发育和应对Cd2+胁迫中具有重要作用，其主要功能为调控细胞膜中磷脂酰胆碱的生物合成。本研究旨在探索CK基因的结构和功能的关系，为各物种的CK基因在Cd2+胁迫下的功能和生化特性研究提供基本框架。结果表明，大多数GhCK基因的表达都受到非生物胁迫的影响，在Cd2+胁迫下，GhCK基因家族成员的表达水平具有不同程度的变化。GhCK5的表达水平显著上调，说明GhCK5在棉花耐Cd2+胁迫中具有重要作用。本研究进一步通过CK基因家族的进化分析以及GhG融的功能验证，探究G办ab基因在棉花应对Cd2+胁迫的分子机制。 (1)对三叶期的陆地棉材料邯242进行4mM Cd2+处理0h、3h、6h、9h、12h和24h，与对照相比，棉花出现叶片失水、叶脉和茎基部发黑的表型。 (2)通过对4mM Cd2+处理9h的棉花RNA.seq的分析，在甘油磷脂代谢途径中发现了耐Cd2+基因CK基因。通过对CK基因家族成员的全基因组鉴定、染色体定位的分析以及基因结构分析等方法对胆碱激酶基因家族进行了研究。在4个主要棉种和其他7种二倍体植物中共鉴定了87个CK基因，其中在陆地棉中鉴定了13个基因。染色体定位结果表明，有7个成员位于At亚基因组上，另外6个成员位于Dt亚基因组上。对三叶期的棉苗进行了冷、热、盐、旱处理后，发现G办CK家族成员出现了不同程度的差异表达，从而验证GhCK家族成员参与了非生物胁迫的调控。在Cd2+胁迫下，GhCK5的上调表达最为显著。 (3)通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)实验将GhCK5基因沉默之后，棉花叶片中磷脂酰胆碱的含量显著降低。4mM Cd2+处理沉默和对照植株后，沉默植株磷脂酰胆碱的含量虽显著增加，但仍显著低于对照植株，且沉默植株长势明显不如对照植株，沉默植株较早出现了叶片萎蔫、叶脉发黑及茎基部发黑的表型，并且SOD活性的增强受到抑制，叶绿素含量降低。通过农杆菌介导的转染拟南芥实验，得到了转GhCK5基因拟南芥。研究发现，较低浓度的Cd2+对对照和转基因拟南芥的萌发没有显著影响，但对照植株的生长状况比转基因拟南芥的差，较高浓度的Cd2+胁迫下，转基因拟南芥的萌发率显著高于对照植株。亚细胞定位的结果显示GhCK5蛋白主要定位在细胞膜，进而验证了GhCK5基因在细胞膜中发挥关键作用。 总之，胆碱激酶基因在细胞膜中能够通过调控磷脂酰胆碱的合成以帮助棉花提高对Cd2+的耐受性。
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