摘要
研究目的: 本研究拟通过对A.coerulea变态发育不同阶段的毒性及主要毒素活性进行评价来探究其在A.coerulea变态发育过程中的动态变化情况，通过主要毒素分子抑制剂对变态发育过程的干预效应来对在变态发育过程中发挥重要作用的毒素种类进行筛选，随后以基因组和多阶段转录组学数据库为数据基础、以生物信息学技术为引导手段，期望归纳提出在A.coerulea变态发育中发挥重要效应的信号调控网络。 研究内容: 1.A.coerulea基因组构建，A.coerulea及近缘物种的比较基因组学分析。 2.A.coerulea水螅体变态发育的物理和化学诱导模型的建立与评价，基于多阶段有参转录组的A.coerulea变态发育过程中主要毒素分子表达量动态变化的分析，A.coerulea变态发育过程中毒性动态变化及主要毒素活性动态变化的评价。 3.主要毒素抑制剂对A.coerulea变态发育过程干预效应的评价，基于多阶段转录组的关键毒素分子及信号通路的筛选。 研究方法: （一）A.coerulea基因组构建及比较基因组学分析 1.A.coerulea基因组学构建 本研究通过PacbioSequel平台进行测序，测序深度为120×。综合利用三代测序、二代测序、10×Genomic和Hi-C对A.coerulea基因组进行组装。 2.A.coerulea及近缘物种的比较基因组学分析 本研究的基因家族鉴定选用OrthoMCL流程，利用单拷贝基因家族序列对各家族进行MUSCLE比对，基于序列比对结果利用RAxML软件采用极大似然法对近缘物种进行系统发育树的构建。使用PAML软件包中的mcmctree进行分歧时间估计，使用Tracer验证其收敛性。 （二）A.coerulea变态发育过程中毒素的动态变化 1.A.coerulea变态发育物理和化学诱导体系的建立 在A.coerulea水螅体实验室微观养殖体系的基础上，分别采用降温至10℃和添加化学诱导剂5-甲氧基-2-甲基吲哚的方式构建A.coerulea水螅体变态发育物理和化学诱导体系。 2.基于多阶段转录组学分析变态发育过程中主要毒素分子表达量的动态变化利用本地Blast工具将基因序列与Uniprot的毒素数据库进行序列比对，利用E-value＜0.00001过滤不合格序列，用最大比对长度和相似度筛选出A.coerulea基因组中的毒素基因。基于NCBI公共数据库获取A.coerulea变态发育不同阶段的转录组测序原始数据，采用快速比对工具HISAT2及量化和确定表达值的工具StringTie获取A.coerulea基因组基因在不同时期的表达量，通过K-Means/K-Medians Clustering对毒素表达情况进行聚类分析。 （三）影响A.coerulea变态发育关键毒素分子的筛选及其作用机制研究 1.关键毒素抑制剂对变态发育的干预效应、关键毒素分子基因敲低及关键毒素分子的筛选 选择蛋白酶或金属蛋白酶抑制剂EDTA、Batimastat、Ilomastat、MMP-9-IN-1、ARP-100、S3304和T-26C，磷脂酶抑制剂或Ca2+拮抗剂QD、DP和EGTA作为潜在抑制剂，将其加入A.coerulea变态发育诱导体系中观察其对A.coerulea变态发育的影响。对高表达的金属蛋白酶进行基因敲低来对关键毒素分子进行筛选。 2.关键毒素分子上游信号通路的生信分析与预测 采用PROMO对可能结合在关键分子序列5’-UTR上游启动子序列的转录因子进行预测，对富集到的前10条KEGG通路进行变态发育多阶段表达量变化的分析，通过K-Means/K-MediansClustering对主要信号通路相关分子的表达情况进行聚类分析。 研究结果: （一）A.coerulea基因组构建及比较基因组学分析 1.A.coerulea的基因组学构建及分析 本研究中A.coerulea基因组的总测序量为66.69G，组装后Contig总长534.63Mbp，N50达到1.54Mbp。组装到染色体水平的序列共有21条，基因组挂载率达99.65%，非冗余重复序列总长为347,322,052bp，占全基因组序列总长的64.66%。本研究中的A.coerulea基因组共预测出基因21,999个，采用NR，SwissProt，KEGG，InterPro，GO以及Pfam等数据库进行比对，最终注释基因总数为21,659个，各数据库分别为17,511，12,593，12,092，21,549，19,478和12,503个。 2.A.coerulea比较基因组学分析 基因家族扩张收缩分析的结果表明，A.coerulea扩张了223个基因家族，收缩了101个基因家族。从物种分歧时间结果看到，A.coerulea与A.aurita（jellyfish Aurelia）所在进化枝的分歧时间约在66.8百万年前。在ADAM、ADAMTS、MMP及Zinc_metalloprotease这4个金属蛋白酶相关家族的拷贝数上，A.coerulea并没有显著的扩张或收缩趋势，而A.digitifera相比于A.coerulea、N.vectensis和H.vulgaris在MMP和Zincmetalloprotease上有收缩趋势。 （二）A.coerulea变态发育过程中主要毒素分子的动态变化 1.成功构建A.coerulea水螅体变态发育物理及化学诱导体系 在物理诱导体系下，A.coerulea水螅体在诱导后的第50天开始出现横裂现象，与之相比，化学诱导体系中水螅体24小时内即可开始横裂，8~9天即可发育为蝶状体，诱导效率更高且相对稳定。 2.A.coerulea主要毒素分子的不同亚型在其变态发育过程中的表达量不同 筛选到的20余类795种毒素分子的表达量从整体水平上来看基本稳定，但就单个毒素分子而言，每一种毒素分子的表达都有其不同的变化特征，而具有近似表达变化特征的毒素又不属于同一类。除此之外，部分金属蛋白酶家族分子还存在早期横裂体阶段特异性高表达的现象，而对于磷脂酶而言，部分分子主要表现为在水螅体和早期横裂体阶段表达量较高，而在随后的晚期横列体、蝶状体阶段表达量则下降。 3.A.coerulea变态发育过程中不同阶段样本蛋白提取物毒性和酶活性不同 A.coerulea水母体的蛋白提取物既无明显的整体动物毒性，又无明显的溶血活性；而A.coerulea水螅体的蛋白提取物对整体动物既有急性毒性，又具有明显的溶血活性。在变态发育早期横裂阶段，金属蛋白酶活性明显升高；而磷脂酶活性在蝶状体阶段最低，在其他阶段较为一致。 （三）影响A.coerulea变态发育关键毒素分子的筛选及其作用机制研究 1.金属蛋白酶抑制剂对A.coerulea变态发育进程有明显的干预效应，而磷脂酶抑制剂的干预效应较弱 广谱蛋白酶抑制剂EDTA、广谱金属蛋白酶抑制剂Ilomastst和Batimastat，MMP-2/9共同抑制剂S3304，MMP-2抑制剂ARP-100、MMP-9抑制剂MMP-9-IN-1以及MMP-13抑制剂T26C等金属蛋白酶抑制剂均能明显延缓A.coerulea水螅体变态发育早期横裂的发生。此外，广谱蛋白酶抑制剂（EDTA）、广谱金属蛋白酶抑制剂和MMP-2/9抑制剂（S3304）还能够明显影响A.coerulea水螅体变态发育的早期横裂率。 2.MAPK和PI3K-Akt两条信号通路可能通过调节金属蛋白酶表达而最终影响变态发育早期横裂的发生 金属蛋白酶CTG_112.19不仅在横裂阶段表达量增加最显著，其RNAi敲低的效率也超过80%。根据CTG_112.19的上游启动子序列，筛选出ZIC2、YY1等10种潜在转录因子。对富集的信号通路进行分析发现，MAPK信号通路相关的关键分子Sos、Ras、Raf、MEK以及ERK，以及核内与金属蛋白酶相关的转录因子c-Jun、c-Fos和c-Myc的表达量在横裂早期均呈现出明显的升高趋势，发挥MAPK经典通路负性调节作用的PI3K-Akt信号通路的关键分子PI3K、Akt等则均表达下调。 研究结论: 1.构建了高质量的A.coerulea基因组，金属蛋白酶家族结构域在A.coerulea及近缘物种间相对保守； 2.构建了A.coerulea水螅体变态发育的物理和化学诱导体系，使用5-甲氧基-2-甲基吲哚作为化学诱导剂比低温诱导具有更高且稳定的诱导效率； 3.在整体水平上来看，毒素表达总体稳定，但就单个毒素分子而言，每一种都有其不同的变化特征； 4.A.coerulea变态发育过程中整体动物毒性、溶血活性、金属蛋白酶和磷脂酶活性都存在着动态变化的现象； 5.金属蛋白酶抑制剂能够延缓A.coerulea水螅体变态发育早期横裂的发生，减少蝶状体产生的数量；磷脂酶抑制剂仅能影响变态发育前24小时的横裂率； 6.毒素分子在变态发育过程中发挥重要作用，环境变化如温度下降可能同步激活MAPK和抑制PI3K-Akt两条信号通路，上调金属蛋白酶表达而最终影响A.coerulea变态发育早期横裂的发生。
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