摘要
非洲猪瘟（Africanswinefever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africanswinefever virus，ASFV）感染引起的一种急性、烈性和高度致死性猪传染病，病死率高达100%。非洲猪瘟严重危害中国生猪养殖行业，目前尚缺乏有效的治疗方法，生物安全是唯一有效防控途径，非洲猪瘟病毒的早期诊断是防控非洲猪瘟蔓延的首要关键。非洲猪瘟病毒经猪肉制品流动散播更为隐蔽，风险性更高，防控难度更大，开展猪肉制品中非洲猪瘟病毒检测，对防止染疫猪肉原料进入食品加工环节具有重要意义。 目前，基于TaqMan探针的实时定量PCR和通用探针库定量PCR的分子检测方法仍是非洲猪瘟诊断的主流方法，但养猪集团的边远猪场、中小规模猪场、农村养殖户不能像规模化猪场建立诊断实验室，应用实时定量PCR进行非洲猪瘟病毒大批量核酸检测。因此，建立敏感、特异、快速的猪肉制品中ASFV的可现场检测方法，对猪场肉品和现场样品进行快速筛查和预检，可为非洲猪瘟防控溯源工作提供线索。 1.非洲猪瘟病毒重组酶介导恒温扩增方法建立 本研究首先针对ASFV的高度保守基因B646L/p72设计多对引物及探针，利用实时定量PCR方法进行敏感性筛选。基于此，建立ASFV重组酶介导恒温扩增（Recombinase aided amplification，RAA）方法。利用普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定该方法的特异性和灵敏度，验证结果如下：该方法检测伪狂犬病病毒、2型猪圆环病毒和猪蓝耳病病毒无交叉反应。该方法对pUC57-p72质控质粒的扩增限为100copies/μl。 2.非洲猪瘟病毒量子点免疫试纸条方法建立 其次，本研究制备异硫氰酸荧光素（FITC）多克隆抗体偶联的量子点荧光探针，基于建立的RAA体系，建立ASFV量子点免疫试纸条检测方法。验证结果如下：该方法检测2型-狂犬病病毒、猪圆环病毒和猪蓝耳病病毒无交叉反应，该方法对pUC57-p72质控质粒的最低检测限为1copy/μl。该方法检对1copy/μl和102copies/μl的pUC57-p72质控质粒的进行批内与批间检测，1copy/μl的批内与批间的变异系数分别为8.621%和8.259%，102copies/μl的批内与批间变异系数分别为7.062%和5.832%，具有良好的重现性。 3.临床样本检测效能评价 最后，通过检测100份阴性猪肉临床样本和20份阳性猪肉模拟临床样本验证ASFV量子点免疫试纸条方法的实际检测效能。验证结果如下：所建立ASFV量子点免疫试纸条方法对阳性模拟临床猪肉样本的最低检测限为100copies/g。该方法检测阳性猪肉模拟临床样本、阴性猪肉临床样本和空白对照的变异系数分别为9.916%、8.681%、5.729%，具有良好的稳定性。该方法与世界动物卫生组织（OIE）颁布的实时定量PCR方法的符合性为99.17%。 综上所述，本研究创新使用非洲猪瘟病毒特异性核酸检测RAA方法和量子点免疫试纸条显示方法，为现场检测非洲猪瘟病毒提供了特异、敏感、稳定、肉眼可观测结果的即时检测方法，可以在25min内完成样本检测，该技术在肉品、中小型规模或偏远地区猪场进行样品预检，对猪肉加工行业防控非洲猪瘟病毒具有较好的应用前景。
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