摘要
白芨是可用于保健类食品的中药材之一，多年来因其较高的药用价值受到国内外学者的广泛关注。而白芨中的多糖类也赋予了其抗肿瘤，抗氧化等生物活性。以往研究得到的白芨多糖大都是通过热水浸提获取而来，而尚未有关于低温提取的白芨多糖和其结构特性以及详细的抗肝癌活性的研究。因此本课题在4℃条件下低温提取白芨多糖，并对其结构表征和体外抗肝癌机理进行鉴定和研究。 本课题以干燥的白芨片为原料，在4℃的条件下浸提24h，通过分级醇沉得到的一种新的白芨多糖，得率为1.1±0.12%。白芨粗多糖在经过Sevage去除蛋白和流水透析后，得到纯化的白芨多糖，命名为BSP-4。通过检测可知BSP-4中含有的总糖的量达到90.99±0.3%。而蛋白质比例仅占0.06±0.01%，糖醛酸则仅含0.47±0.05%，可以忽略不计。 随后对其结构特征进行鉴定。高效液相色谱、傅里叶红外光谱和离子色谱结果表明BSP-4是一种由葡萄糖和甘露糖以1.00:1.26的摩尔比组成的分子量为23kDa的低分子量中性多糖，具有α和β两种类型的糖苷键。结构鉴定实验的结果表明BSP-4的主链包括(1→4)-α-D-Glcp(50.15%)，(1→4)-α-D-Manp(22.61%)，(1→3)-α-D-Manp(25.72%)及(1→)-β-D-Manp(1.52%)。且通过这一系列的结构实验，我们得出BSP-4的连接顺序为：α-D?Manp-(1→3)-β?D?Manp-(1→[4)-β?D?Glcp-(1]2→4)-β?D?Manp-(1→3)-β?D?Manp-(1→。 此外，我们还研究了BSP-4对HepG2和H22两种肝癌细胞的抑制作用。MTT结果表明在800μg/mL的BSP-4浓度下，其抑制率分别为73.66%(HepG2)和78.08%(H22)。形态学观察和Hoechst染色结果显示，BSP-4处理后的细胞出现明显的形态学变化和典型的凋亡特征；Annexin V-FITC/PI双染、Tunel染色和细胞周期检测结果证实了BSP-4将HepG2细胞阻滞在S期并诱导其发生凋亡，其凋亡率为44.24%，H22细胞阻滞在G2期，其凋亡率为68.57%。同时也检测到线粒体膜电位受到破坏，影响到了其正常功能的发挥；活性氧在细胞内非正常的累加。免疫印迹杂交对凋亡相关蛋白表达状况的检测结果表明BSP-4能帮助HepG2和H22细胞内于凋亡有益的Bax蛋白的表达，降低了Bcl-2蛋白的表达量，此蛋白有抑制促凋亡蛋白生长的功能。Cyt-c蛋白水平以上调形式表现出来，此外执行凋亡的Caspase3和Caspase9剪切体的蛋白表达也显示出上升的趋势，这说明BSP-4是通过改变与线粒体通路有关蛋白的表达来实现将HepG2和H22细胞诱导发生凋亡的。 本论文中低温提取了一种新型白芨多糖，并对其结构和体外抗肝癌活性进行了研究。这些研究结果可为BSP-4作为功能性保健食品的开发利用提供理论支持和新思路。
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