摘要
葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）是一种黄素糖蛋白，属于氧化还原酶，在一定条件下能专一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖酸可以作为色素稳定剂、酸化剂和螯合剂等，被广泛应用于食品、医药、纺织和土木等领域，因此葡萄糖氧化酶具有十分重要的作用。现阶段研究报道的产葡萄糖氧化酶微生物主要是青霉和黑曲霉等，但它们发酵周期长，产酶效率低，副产物多，不利于分离纯化。 本文以实验室保藏的黑曲霉为出发菌株，通过多序列比对设计简并引物，克隆到黑曲霉葡萄糖氧化酶基因，构建了其重组表达载体并实现了葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的异源表达。为了进一步提高GOD表达量，克隆了四个能提高GOD表达量的共表达分子伴侣Ero1基因、PDI基因、Sec1基因和Sly1基因，与葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中共表达，筛选出重组GOD表达量最高的共表达菌株，在30L发酵罐中进行发酵放大实验，分离纯化GOD，研究其酶学特性。具体研究内容及结果如下： 1.以实验室保藏的黑曲霉Aspergillus niger为出发菌株，提取其基因组DNA作为模板，利用多序列对比设计简并引物，扩增出黑曲霉GOD的完整基因。构建重组质粒pPICZɑA-GOD，转化至毕赤酵母Pichia pastoris GS115中表达GOD。在摇瓶水平筛选出酶活最高的转化子，甲醇诱导96h后GOD酶活达到32.25U/mL。在30L发酵罐的发酵放大实验中，甲醇诱导96h后GOD酶活达到307.52U/mL，酵母生物量达到260g/L。经SDS-PAGE分析，重组葡萄糖氧化酶分子量约90kDa，发酵液上清中GOD纯度高，杂蛋白少，有利于纯化。 2.从毕赤酵母基因组DNA中扩增出分子伴侣Ero1基因、PDI基因、Sec1基因和Sly1基因，分别插入到pPIC9k载体上，构建共表达重组质粒，转化至毕赤酵母GS115/pPICZɑA-GOD。摇瓶水平对比显示，共表达分子伴侣Ero1基因、PDI基因、Sec1基因和Sly1基因分别使重组葡萄糖氧化酶的表达量提高了72%、243%、44%和27%。以PDI基因为共表达分子伴侣时，GOD表达酶活最高，达到110.96U/mL。在30L发酵罐的放大实验中，甲醇诱导共表达菌株GS115/pPICZɑA-GOD/pPIC9k-PDI96h后发酵上清液中GOD酶活达到1562.35U/mL，酵母生物量达到426.47g/L，相比重组酵母GS115/pPICZαA-GOD，酶活提高了400%，酵母生物量提高了64%。 3.通过镍柱亲和层析纯化得到重组葡萄糖氧化酶，酶活回收率达到84.9%，纯化倍数为4.8，重组葡萄糖氧化酶的比酶活为178.7U/mg。通过单因素实验，测得重组GOD的最适反应温度为40℃，最适反应pH为6.0，70℃热处理30min时重组GOD基本丧失活性。浓度为0.1mmol/L的大部分金属离子（除Mn2+）对重组GOD活力有较弱的抑制作用，随着金属离子的浓度增高到1mmol/L，对重组GOD活力的抑制作用也增强。1mmol/L Mn2+对重组GOD活力具有明显的促进作用，使相对酶活提高了10%。该重组酶对不同浓度葡萄糖的动力学参数Km和Vmax分别为23.44mmol/L和429μmol/L·min。
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