摘要
ε-聚赖氨酸（ε-poly-l-lysine，?-PL）是一种安全性高、抑菌谱广的食品防腐剂，已广泛用于食品、医学和生物材料等领域。我国于2014年4月批准了ε-聚赖氨酸作为食品添加剂新品种。天然生物防腐剂ε-聚赖氨酸具有广阔应用前景，但目前聚赖氨酸发酵水平较低，生产成本较高，限制了其进一步的开发和应用，迫切需要提高发酵水平、降低生产成本和销售价格。 本实验室前期以一株淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenesTUST作为出发菌株，通过对其进行一系列诱变获得了菌株Streptomyces diastatochromogenes6#-7，但其ε-聚赖氨酸高产机制还尚不清楚。因此本论文基于上述两株聚赖氨酸产生菌的转录组学数据出发，利用分子生物学手段考察了赖氨酸脱羧酶基因cadA及脂肪酸ACP合酶基因fabF对ε-聚赖氨酸产量的影响。主要研究结果如下： （1）本论文利用接合转移的方法成功构建了四株基因工程淀粉酶产色链霉菌，并通过RT-qPCR验证、亚甲基蓝初筛、摇瓶复筛等方法验证，得到ε-聚赖氨酸产量优异的基因工程菌株。 （2）本论文对四种基因工程菌株与其出发菌株分别进行发酵罐发酵，结果表明：与出发菌株相比，基因改造工程菌株的菌体生长曲线与出发菌株相似，但其ε-聚赖氨酸产量各有不同，其中基因工程菌株S.diastatochromogenesΔcadA较其出发菌株S.diastatochromogenes TUST的ε-PL产量提高了13.0%。S.diastatochromogenesΔfabF1、S.diastatochromogenesΔfabF2、S.diastatochromogenesΔfabF3较其出发菌株S.diastatochromogenes6#-7的ε-PL产量分别提高了27.2%、24.4%、31.0%。5L发酵罐补料分批发酵结果表明淀粉酶产色链霉菌聚赖氨酸生物合成代谢途径中，缺失赖氨酸降解途径中赖氨酸脱羧酶基因cadA及脂肪酸合成途径中脂肪酸ACP合酶基因fabF均可以提高淀粉酶产色链霉菌中ε-PL的产量。 （3）为了验证脂肪酸ACP合酶基因fabF对ε-PL产量的具体影响，对基因改造菌株ΔfabF1、ΔfabF2、ΔfabF3及其出发菌株6#-7进行一系列验证。首先利用扫描电子显微镜观察菌丝形态，发现敲除fabF基因后菌丝较出发菌株干瘪，孢子较塌陷。其次检测脂肪酸合酶活性发现，敲除菌株ΔfabF酶活明显下降。最后，利用GC-MS检测脂肪酸含量，发现改造后的菌株ΔfabF中饱和脂肪酸含量减少，这是由于敲除了脂肪酸合酶，使脂肪酸代谢减弱，减少了乙酰辅酶A消耗，进而使TCA循环增强，能量供给二氨基庚二酸合成途径。然而，不饱和脂肪酸的比例在改造菌株中大大提高，这导致了基因改造菌株细胞膜的流动性增强，有利于物质运输和能量代谢，增加胞外产物聚赖氨酸运输量。这两方面导致了改造菌株中ε-PL产量增高。 （4）最后，利用RT-qPCR验证与ε-PL合成相关代谢途径中关键基因转录水平，结果表明工程菌株ΔfabF3中在TCA循环及二氨基庚二酸途径中关键酶基因表达量均提高，且ε-PL合成酶表达量上调了2.02倍，可将其逐级放大发酵，用于工业生产ε-PL。
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