摘要
马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)是引起妊娠母马后期流产的主要原因，也可造成公马睾丸炎、小马驹败血症和多发性关节炎。它是一种只限制于马属动物的致病菌，且极易被忽视。常引起流产风暴，在短时间内波及大量受感染的母马，造成巨大的经济损失，影响了我国养马业的发展。因此，建立一种快速、准确的检测方法对本病的诊断及防控至关重要。ELISA检测方法是目前国内外较流行的疫病诊断、防控的主要方法之一，但国产检测试剂存在最大的问题是质量不稳定，批间和批内差异大，严重的影响了市场占有率，目前国内市场基本被进口试剂垄断，为了改变这种局面，解决“卡脖子”的技术问题，检测试剂盒的规模化生产工艺研究迫在眉睫。 本研究以去除His标签的重组鞭毛FljB蛋白为包被抗原，建立了马流产沙门菌抗体检测的间接ELISA方法，并优化工作条件，对酶标板、样品稀释液、酶标二抗保护剂等试剂进行筛选，制定其原料的质量标准，同时完成自动化生产工艺的研究。达到500块/批的产量，使批间和批内差异P小于10％。并通过技术推广使试剂盒应用达到l万份以上，对临床样品检测结果进行分析，制定相关标准，最终成为马流产沙门菌病综合防控技术重要的一部分。研究内容及结果如下: (1)采用方阵棋盘法选择抗原最佳包被浓度及待检血清最佳稀释浓度，然后对间接ELISA各流程工作条件筛选，选则P/N值最大为最佳工作条件。最终确定，抗原最佳包被浓度为1μg/mL，最佳包被液为CBS，最佳包被条件4℃过夜;最佳封闭液为含5％脱脂乳的PBST，封闭条件37℃2h;待检血清最佳稀释浓度1∶200，工作条件37℃45min;酶标二抗最佳稀释浓度1∶30000，孵育条件37℃30min。底物溶液37℃显色10min。 (2)在间接ELISA最佳工作条件的基础上，对试剂盒所需酶标板、样品稀释液、酶标二抗保护剂等原辅料进一步筛选，综合性能、质量和成本等多种因素，确定原料标准。同时在大规模生产前对试剂盒中相关变量进行模拟验证，检验时间、操作人员等的变化对试剂盒检测结果的影响。结果表明，包被前持续搅拌对抗原蛋白有较大破坏，其他条件的变化对试剂盒的影响均在可允许范围之内。 (3)按照问接ELISA操作流程的最佳工作条件，对三批纯化好的蛋白进行实验室试制。每批100块。通过计算234份阴性样品酶标仪OD450nm读数的平均值和标准差确定试剂盒的临界值为0.302;通过对强阳性、阳性、弱阳性标准血清梯度稀释，确定本试剂盒敏感性检出的最低稀释度为1∶3200，且30份已知弱阳性、阳性临床血清样品的阳性检出率为100％;对30份己知阴性血清样品的阴性检出率为100％，且与都柏林沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、马大肠杆菌及马链球菌的特异性IgG抗体没有交叉反应;重复性试验结果显示，其批内、批间变异系数介于0.82％-7.54％，表明本试剂盒具有良好的重复性;且试剂盒保存期可达6个月以上。 (4)使用自动化生产设备对试剂盒进行中期试制，生产规模扩大至200块/批，用于临床推广应用。与国内部分马场签订定向协议，使本试剂盒推广应用达10000份以上，并用临床血清样品验证其符合率、敏感性、特异性和重复性。结果显示，对来自不同地区马场的共1240份临床血清样品总阳性检出率为18.0％;对本试剂盒判定为阳性和阴性各120份临床血清样品用试管凝集试验检验，阳性符合率为100％.阴性符合率为95.83％，总符合率为97.92％;对10份已知阳性的临床血清样品敏感性检验，阳性检出率为100％，最低检出稀释度可达1∶12800;对10份已知阴性的临床血清样品特异性检验，其阴性检出率为100％;对15份已知阳性的临床血清样品和15份已知阴性的临床血清样品，阴阳性检出率均为100％，批内、批间变异系数介于1.37％-9.65％。 综上所述，本试验成功研发了一种检测马流产沙门菌血清抗体的间接ELISA试剂盒，经工作条件优化、原辅料的筛选及大规模生产前的验证，试剂盒稳定性提升，且敏感性、特异性、重复性良好，符合率较高。本研究为兽医临床检测马流产沙门菌血清抗体提供了理论基础，为本试剂盒的上市应用提供了数据支撑。
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