摘要
心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全球范围内导致患者死亡的最主要病原性因素之一。血管内皮细胞与CVD息息相关，现有的药物治疗和手术治疗方案不能从根本上改善受损的内皮细胞功能。随着干细胞技术的发展，细胞移植治疗为血管内皮修复治疗提供了可能。诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)有效回避胚胎干细胞相关伦理问题，为代替ESCs的细胞移植治疗提供更多便利。 目前关于iPSCs定向分化为血管内皮细胞的研究多集中于人和小鼠。家猪作为大型哺乳动物，它们在个体大小、生理结构、免疫系统和营养代谢等方面与人类高度相似，在病理毒理学测试巾确定药剂的安全剂量及基因编辑等都具有一定的优势，更适合做人类生物医学模式动物。近年来，猪作为重要的心血管疾病的动物模型很受欢迎，但利用猪的诱导多能性干细胞(porcine induced pluripotent stem cells，piPSCs)进行定向分化为内皮细胞的研究报道非常少。早在2013年，美国科学家首次报道了利用拟胚体分化的方式将猪iPSCs诱导分化为血管内皮细胞的方法。2020年，我们实验室建立了一种培养液成分相对简单、无血清无饲养层的单层piPSCs定向分化为血管内皮细胞的方法，该方法得到的血管内皮细胞在基因表达、形态结构以及体内体外成血管能力等方面与体内来源的血管内皮细胞具有很好的可比性。然而，考虑到我们的诱导体系分化效率不高，极大程度上依赖流式分选纯化的现象，本课题开展了以下三方面研究:(1)猪iPSCs来源的血管内皮细胞(piPSC-ECs)在小鼠后肢缺血模型中的修复作用:(2)通过高通量测序及生物信息学分析piPSC-ECs分化过程的主要分子事件;(3)研究了TGF-β信号通路在piPSC-ECs分化过程中的作用。 本研究中，我们采用实验室已有的猪诱导多能干细胞系Pilw4作为源头细胞，通过单层细胞诱导法获得猪iPSCs来源的血管内皮细胞(piPSC-ECs)进行细胞移植效果评价。在小鼠下肢慢性缺血模型的缺血部位分别注入piPSC-ECs、猪胎儿成纤维细胞(porcine fetalfibroblasts，PFFs)和等体积的内皮细胞培养液EGM-2。细胞移植后对其进行活细胞示踪检测，结果发现细胞信号衰减迅速;细胞移植28d后，通过苏木精.伊红染色、免疫组化、细胞凋亡等技术对细胞注入部位进行组织形态学检测，结果发现piPSC-ECs移植组的组织最完整，体内成血管的数量也最多。随后基于诱导分化流程，我们在多个时间点收集样本进行单细胞转录组测序，生物信息学分析提示TGF-β信号通路或许在piPSC-ECs分化过程中发挥重要作用。针对这一发现我们设立了8个实验组，分别在piPSC-ECs分化过程中的不同时间段添加小分子抑制剂SB431542抑制TGF-β信号通路。通过免疫蛋白印迹实验检测TGF-β信号的胞内转导蛋白Smad2和Smad3的表达及其磷酸化水平、通过Real time-PCR技术检测各处理组的中胚层和内皮基因的表达情况、通过流式细胞术检测各处理组的CD31阳性率，从而分析TGF-β信号通路在整个诱导过程中的作用。 综上所述，我们通过无血清无饲养层的单层细胞诱导分化法得到的piPSC-ECs具有修复小鼠后肢缺血的能力，且piPSC-ECs分化过程中，TGF-β1的分泌水平及Smad2/3磷酸化水平呈现动态变化，该信号的活化对于piPSCs向中胚层分化具有促进作用，对于细胞进一步的内皮化具有抑制作用。本研究为深入了解TGF-β信号通路在piPSCs定向分化为内皮细胞过程中的调控的作用提供了详实的实验证据，为piPSC-ECs诱导体系的优化奠定了基础。猪血管内皮细胞的获得及其功能研究不仅能够为人类血管内皮细胞移植提供实验数据，也将为心血管药物筛选平台的建立、血管内皮分化和功能障碍的机制研究提供有益参考。
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