摘要
D-阿拉伯糖醇（D-arabitol）是一种重要的功能性糖醇，在食品、医药和化工等领域具有重要的发展潜力和市场价值。目前，利用生物法生产D-阿拉伯糖醇的研究多集中在天然菌株的筛选以及发酵条件优化等方面，针对代谢工程改造方面的研究较少。鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一种天然的D-阿拉伯糖醇生产菌株，常用于酱油酿造，是一种安全的食品生产菌株。本研究以鲁氏酵母为出发菌株，对原始菌株进行了ARTP诱变，获得了一株D-阿拉伯糖醇高产菌株；随后，优化了突变株生产D-阿拉伯糖醇的发酵条件；最后，结合转录组学分析结果，挖掘与D-阿拉伯糖醇生产相关的基因与代谢通路，阐明突变菌株D-阿拉伯糖醇产量提升的分子机制，并据此进行鲁氏酵母的代谢工程改造，进一步提升D-阿拉伯糖醇的产量。主要研究结果如下： （1）采用不同的ARTP处理时间确定了原始菌株Z.rouxii ST109的致死率曲线，随后经过诱变筛选，得到了突变株Z.rouxii M075，其D-阿拉伯糖醇产量为42.01g/L，相较于原始菌株提高了49.6%。 （2）对突变株Z.rouxii M075进行了发酵条件的优化，包括培养基成分和培养条件。得到D-阿拉伯糖醇发酵的最佳培养基成分为：葡萄糖300g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母提取物12g/L，硫酸铵1g/L，反丁烯二酸10g/L，Triton X-1001.5%（v/v）。最佳培养条件为：接种量5%（v/v），发酵时间96h，发酵温度30℃。在最佳条件下，D-阿拉伯糖醇产量为58.19g/L，比优化前提高了38.9%。后续根据菌株生长和发酵最适温度不同，采取了变温发酵策略，进一步提高了D-阿拉伯糖醇产量，产量为64.22g/L，相比于30℃恒温发酵提高了10.36%。 （3）采用转录组学技术分析了突变株Z.rouxii M075和原始菌株的差异，获得了差异表达的基因，并开展了差异基因的GO富集、KEGG代谢通路等分析比较，从功能角度初步分析了关键基因和蛋白的差异性表达对D-阿拉伯糖醇生产的影响机制。 （4）基于转录组学分析结果，对Z.rouxii M075的磷酸戊糖途径进行针对性的代谢改造，对代谢途径上游的两个关键基因gnd和zwf进行过表达，利用无缝克隆技术成功构建了两个重组质粒pGAP-gene，并分别在鲁氏酵母基因组中实现了整合表达，结果表明分别过表达gnd和zwf两个基因，均有助于提升D-阿拉伯糖醇的产量。
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