摘要
目的： HIF-1α在肝脏纤维化、心肌纤维化等疾病中发挥重要作用，但其在矽肺中的作用以及机制还未被阐明。本研究通过构建实验性小鼠矽肺模型及NIH-3T3细胞体外转分化模型，从不同层次探索HIF-1α在矽肺中的调控作用及其分子机制，为进一步阐明矽肺发病机制提供依据，为探寻有效的矽肺干预手段提供新的思路和参考依据。 材料与方法： 1.主要材料 NIH-3T3小鼠肺成纤维细胞购自中国科学院细胞库;雄性、4周龄C57BL/6N小鼠(15～20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 2.研究方法 2.1NIH-3T3细胞体外转分化模型构建及HIF-1α表达变化及其作用机制观察 使用不同浓度的TGF-β1处理NIH-3T3细胞建立转分化模型。以Westem blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白表达水平，RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1αmRNA表达水平。 使用7.5ng/mL的TGF-β1处理NIH-3T3细胞，在不同时间使用以Western blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白表达水平，RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1αmRNA表达水平。 分别使用DMOG、KC7F2、SIS3和HIF-1α/NC-siRNA干预转分化模型。使用Western blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α、SMAD3及PSMAD3蛋白表达水平。RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1αmRNA表达水平。 2.2小鼠矽肺模型中HIF-1α的表达变化检测及干预效果观察 将40只C57BL/6N小鼠随机分为生理盐水对照组、矽肺模型组、干预对照组以及KC7F2干预组。通过非暴露式气管滴注100μL SiO2粉尘悬浊液(50mg/mL)建立矽肺模型（生理盐水对照组滴注等量生理盐水），KC7F2组小鼠按3天一次的频率腹腔注射KC7F2溶液（0.75mg/kg）,干预对照组小鼠注射等量生理盐水。使用HE和Masson染色评估小鼠肺组织损伤及纤维化程度，使用免疫组化检测小鼠肺组织COLIA1与HIF-1α蛋白表达水平。通过Westem blot技术检测α-SMA、COLIA1、HIF-1α、SMAD3及PSMAD3蛋白表达水平。RT-qPCR检测α-SMA、COLIA1、HIF-1αmRNA表达水平。 3.统计学分析 实验数据采用SPSS25.0统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组样本间差异比较采用Student''s t检验，多样本差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。 结果： 1.NIH-3T3细胞转分化模型的构建及HJF-1α作用机制的观察 1.1不同浓度TGF-β1处理对NIH-3T3转分化模型的影响 0、2.5、5、7.5、10ng/mL TGF-β1处理NIH-3T3细胞24h，α-SMA蛋白及mRNA表达水平、pSMAD3/SMAD3比值在5ng/mL时显著升高，COLIA1蛋白及mRNA表达水平、HIF-1α蛋白的表达水平在7.5ng/mL时显著升高，HIF-1αmRNA表达水平未发生改变。 1.2不同时间TGF-β1处理对NIH-3T3转分化横型的影响 7.5ng/mL TGF-β1处理NIH-3T3细胞0、2、4、6、8、10、12、24、48h，COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平不断升高;HIF-1α蛋白表达水平与pSMAD3/SMAD3比值先升高后下降，在4h时达到最大值。 1.3干预HIF-1α对NIH-3T3转分化模型的影响 与Control组相比，DMOG组中COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值升高;KC7F2组、HIF-1α-siRNA组COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平及pSMAD3/SMAD3比值下降。 1.4同时干预HIF-1α与pSMAD3对NIH-3T3转分化模型影响 与Control组相比，DMOG组COLIA1、α-SMA蛋白及mRNA表达水平、pSMAD3/SMAD3比值升高。与DMOG相比，DMOG+SIS3组中COLIA1、α-SMA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值降低。 2.小鼠矽肺模型的建立以及KC7F2干预效果的观察 2.1KC7F2干预HIF-1α表达对矽肺小鼠肺组织病理改变的影响 Silica组小鼠肺组织均出现肺泡壁的破坏及增厚、不同程度的炎性聚集、细胞外基质分泌增多等现象，且病变严重处出现细胞结节。与Silica组相比，KC7F2组小鼠肺组织的炎性聚集、浸润程度降低。 2.2KC7F2干预HIF-1α表达对矽肺小鼠肺组织mRNA与蛋白表达水平的影响 与Saline组相比，Silica组中α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白及mRNA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值均明显升高。与Silica组相比，KC7F2组α-SMA、COLIA1、HIF-1α蛋白及mRNA表达水平与pSMAD3/SMAD3比值均降低。 结论： HIF-1α能够促进SMAD3的磷酸化，促进NIH-3T3细胞转分化为肌成纤维细胞。干预HIF-1α的表达能够抑制实验性小鼠矽肺的肺部损伤与纤维化的发生发展。
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