摘要
细胞膜作为活细胞与微环境的边界，不但能够维持细胞形态，而且在细胞交流和信号传导中起着重要作用。细胞膜厚度仅5-8纳米，用普通光学显微镜无法清晰地观察细胞膜与内部结构，影响对细胞膜功能的研究。小分子荧光探针是近些年来发展迅速的一种光学细胞标记技术，凭借其灵敏度高、选择性好、合成简便、生物相容性好等优点被广泛应用于细胞的生理功能和疾病诊断。γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptor,GABAAR)作为细胞膜上的一种离子通道受体，整个受体上分布多个特异性药物结合位点，如GABA、苯二氮卓类、巴比妥类等，这些结合位点往往也是GABAAR药物的筛选靶点;同时，这些结合位点也为设计具有特异性结合GABAAR的细胞膜荧光探针提供了科学依据。为了探讨这种可能性，本论文以巴比妥酸为GABAAR靶向单元，制备了2个具有特异性结合细胞膜上GABAAR的小分子荧光探针，具体内容如下: 1、以2，4，6-嘧啶三酮与4-二甲氨基肉桂醛为原料，采用化学合成法制备了荧光探针(探针1)，该探针结构上具有扭曲的分子内电荷效应(TICT)，对极性与粘度均有良好的响应性。商业化膜染料DiO与探针1共定位实验表明，探针1能特异性靶向细胞膜，两者的皮尔森系数为0.8，且探针的稳定性优于DiO。印防己毒素共孵育实验及分子对接结果显示，探针1能特异性结合GABAAR，当探针1分子进入GABAAR的离子通道后，受离子通道内部小极性的影响，使探针分子的结构趋于平面化，导致TICT效应受到抑制，荧光增强。研究表明，癌细胞中的粘度通常比正常细胞高，且GABAAR的多种亚型在体内或体外肝癌细胞株HepG-2过度表达，表达量与肿瘤的分化程度密切相关。细胞成像实验表明，探针1与HepG-2细胞膜结合的荧光强度显著高于与正常肝细胞LO2细胞膜的结合，能明显区分正常肝细胞与肝癌细胞，且分子印迹进一步证明这种差异性与两种细胞膜上GABAAR的表达量密切相关。而动物体内肿瘤成像与人体组织样品检测实验进一步显示，探针1同样能显著区分肝癌组织与正常肝组织，为实现临床上肝癌的早期可视化检测及诊断提供了实验基础。 2、以3-氯-7-(二乙氨基)丙烯醛和2，4，6-嘧啶三酮为原料，通过化学方法合成了一种香豆素衍生物荧光探针(探针2)。实验研究结果表明，由于探针2结构上具有GABAAR靶向单元—巴比妥酸，因此，探针2也能特异性结合GABAAR，实现细胞膜的可视化标记，也是一种具有区分肝癌组织与正常肝组织特异性探针。与探针1相比，探针2的共轭结构扩大使得发射波长红移至660nm，可进一步消除检测样品的背景噪音，提高检测的灵敏度，为开发出特异性更好的靶向细胞膜的近红外荧光探针提供了新的设计思路。 综上，本论文采用化学合成法，以巴比妥酸为识别位点，合成了2个具有特异性结合GABAAR的小分子荧光探针，并实现了肝癌细胞与正常肝细胞的区分，起到肝癌可视化检测的作用，为临床肝癌的早期诊断提供了实验基础，同时也为后续设计开发具有细胞膜靶向、特异性肝癌靶向的新型的荧光探针奠定了科学依据。
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