摘要
CAR-T细胞疗法在CD19阳性的淋巴瘤患者和急性淋巴细胞白血病患者中有较好的治疗效果。但是实体瘤治疗过程中，由于实体瘤的抗原特异性和高度免疫抑制的肿瘤微环境等问题，CAR-T治疗存在很大局限性。溶瘤病毒是自然存在或经基因改造后具有杀伤肿瘤能力的一类病毒，它可以选择性地感染肿瘤细胞并在其中复制，然后原位裂解肿瘤细胞，以此发挥杀伤作用；原位裂解肿瘤细胞可以在肿瘤微环境中产生空间，增加肿瘤可及性；感染后的肿瘤细胞会释放肿瘤相关抗原，肿瘤相关抗原会募集T细胞，并促进其增殖；还可能释放病原相关分子模式和损伤相关分子模式，介导全身性的抗肿瘤免疫活性。 本课题组前期已构建有重组Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV2），其抗瘤活性已在前期证明，已进入Ⅱ期临床试验。此外，本实验室前期已报道，相比对照组，荷瘤小鼠经oHSV2治疗后，小鼠脾脏中CD8+T淋巴细胞、DC和NK细胞活化比例增高，并且肿瘤组织的基因集变异分析结果显示，oHSV2治疗组肿瘤微环境中的抗原递呈显著高于对照组。因此，本研究提出假设：oHSV2与CAR-T细胞疗法联合使用，能通过改善肿瘤微环境激活CAR-T细胞，增强CAR-T细胞对表达靶标分子的肿瘤细胞的杀伤。为验证这一设想，本研究采取以下策略： 首先，验证CARs结构是否可以与CD19分子特异性识别并结合。利用慢病毒三质粒载体系统：pLVX-h1928ζ-tag-IRES-EGFP、psPAX2和pMD2.G包装携带CARs基因序列的慢病毒，其中载体质粒pLVX-h1928ζ-tag-IRES-EGFP的构建和鉴定前期已完成，用包装得到的慢病毒感染T细胞和Jurkat细胞以制备CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞；采用PiggyBac转座子系统构建稳定表达CARs结构靶向蛋白CD19的4T1细胞；为验证CAR-Jurkat细胞能否在体外识别表达CD19分子的肿瘤细胞，以CAR-Jurkat细胞作为效应细胞，4T1-CD19细胞作为靶细胞，在体外共培养之后，采用实时荧光定量PCR检测CAR-Jurkat细胞中IL-2及TNF-α的变化情况。实验结果显示，4T1-CD19细胞与CAR-Jurkat细胞共孵育之后，CAR-Jurkat细胞中IL-2及TNF-α表达上调，说明CAR-Jurkat细胞可以在体外作为模拟CAR-T细胞的模式细胞，识别表达CD19分子的肿瘤细胞并被其激活，Jurkat细胞经CARs结构激活之后IL-2及TNF-α会上调表达。 其次，探究CAR-T对BGC823-CD19的杀伤及oHSV2联合CAR-T细胞对BGC823-CD19的杀伤。在体外实验中，用活细胞实时无标记系统验证了CAR-T细胞对BGC823-CD19细胞的杀伤，结果显示，CAR-T细胞在效靶比为5∶1和10∶1时，对靶细胞BGC823-CD19杀伤率达到100%，在CAR-T细胞杀伤过程中，从RNA水平和蛋白水平均检测到，CAR-T细胞中的IL-2上调表达；在低效靶比的CAR-T细胞联合低MOI的oHSV2体外杀伤实验中，二者联用的杀伤效果强于单一使用组；在体内实验中，建立BGC823-CD19荷瘤裸鼠模型，观察并比较对照组、CAR-T治疗组、oHSV2治疗组和CAR-T联合oHSV2治疗的裸鼠肿瘤体积，实验结果显示，联合治疗相比单一疗法能更快的减小肿瘤，且实验结束时所有小鼠肿瘤全部消退。 最后，为进一步探究oHSV2增强CAR-T杀伤活性的初步机制，本研究将oHSV2感染肿瘤细胞之后的上清与CAR-T细胞共孵育，结果显示oHSV2感染后的上清可增强CAR-T的杀伤；将oHSV2感染肿瘤细胞后的上清与CAR-Jurkat细胞共孵育后，CAR-Jurkat细胞中IL-2表达显著上调，结果说明，oHSV2增强CAR-T杀伤活性与IL-2相关；在加入NFκB、NFAT和AP-1三种转录因子的抑制剂后，IL-2的表达受到抑制，说明oHSV2感染肿瘤细胞后的上清激活CAR-Jurkat细胞与NFκB、NFAT和AP-1所在信号通路有关；对oHSV2感染肿瘤细胞后的上清进行蛋白质谱分析，发现经oHSV2感染的肿瘤细胞上清有大量热激蛋白，结果提示oHSV2感染肿瘤细胞后的上清激活CAR-Jurkat细胞可能与热激蛋白有关。 本研究说明，oHSV2可增强CAR-T细胞对表达靶标分子的肿瘤细胞的杀伤，这种增强作用与IL-2相关，为后续进一步机制研究提供实验基础。
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