摘要
北极狐(Alopex Lagopus)毛皮具有较高的经济价值，断奶期腹泻是困扰北极狐养殖业健康发展的主要问题之一。抗生素使用易引发耐药性、环境及食品安全问题，益生菌对动物机体具有免疫调节作用，能够提高动物生长性能，是当前禁抗背景下抗生素替代的理想候选。目前益生菌产品中核心菌株仍以进口为主，多来源于人类和乳制品，犬科动物源益生菌的研究及应用仍然较少。同时，北极狐出生后肠道菌群定植规律及狐源益生菌对其腹泻的治疗效果仍不明晰。因此，在了解初生至断奶后北极狐肠道菌群组成和变化的基础上，通过体外细胞试验，筛选抗逆性强、抗炎和抗氧化活性较高的狐源植物乳杆菌J3，利用PacBio Sequel和Illumina HiSeq高通量测定分析植物乳杆菌J3全基因组序列，比较基因组分析目标菌株微生物功能的特异性及其功能来源;通过构建小鼠肠道黏膜屏障损伤模型，验证目标菌株植物乳杆菌J3对炎症的抑制及对肠道屏障损伤、菌群失衡的治疗作用，利用转录组学和蛋白组学分析揭示其可能的作用机制;最后，再将目标菌株植物乳杆菌J3用作断奶期北极狐饲料添加剂，探究其对断奶期北极狐生长性能、免疫功能、肠道屏障和肠道菌群的影响，以验证其防治效果。 1.北极狐出生后肠道菌群变化: 通过16S rDNA基因序列分析北极狐肠道微生物群落的多样性。取1、5、10、16、30、45和60日龄的健康北极狐十二指肠、回肠和结肠内容物。结果表明，北极狐出生后随着日龄增加各肠段微生物多样性波动升高，并受断奶过程影响。北极狐肠道中最丰富的门依次是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)，其中变形菌门的比例较高;幼龄北极狐厚壁菌门与拟杆菌门比值if/a)也随着日龄不断变化，以十二指肠为例，出生后F/B逐渐升高，断奶后采食饲料后，F/B接近3:1。幼龄北极狐杆菌纲(Bacilli)最为丰富，十二指肠、回肠和结肠占比均在20.00％以上，梭菌纲(Clostridia)尚未形成优势菌群。乳杆菌目(Lactobacillales)是北极狐各肠段的优势菌种，随着日龄乳杆菌目比例不断增加，特别是30d和45d十二指肠和结肠中占1/4以上，断奶后显著下降。链球菌科(Streptococcaceae)是北极狐肠道的优势菌科，断奶前各肠段肠球菌科(Enterococcaceae)的丰度较高{结肠中发现大量的链球菌属(Streptococcus)，平均在5.62％以上，但十二指肠中少量存在。断奶前结肠中乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和Collinsella属占主导地位，断奶后均显著下降。从肠道的空间异质性看，幼龄北极狐肠道菌群尚处于快速定植和发育阶段，3个肠段菌门组成相近，但从十二指肠到结肠的菌群多样性和总数普遍增加，需氧或兼性厌氧菌在小肠中占主导地位，如魏斯氏菌属(Weissella)、肠球菌属(Enterococcus)和链球菌属(Streptococcus)，而厌氧菌在大肠中生长旺盛，如乳杆菌属和拟杆菌属(Bacteroides)。 2.益生菌筛选结果如下: (1)通过基本益生特性初筛及体外抗炎试验复筛，筛选具有优良抗炎能力乳杆菌菌株。从45日龄北极狐结肠内容物中分离纯化19株植物乳杆菌，其中菌株Jl、J2、J3、J4、J6和J12具有较强的胃肠液耐受能力，菌株儿、J3、J4、J12和J25对Caco.2细胞具有良好黏附性能，与阳性对照菌株WCFSl无显著差异;因此，植物乳杆菌儿、J3、J12具有良好的基本益生特性。通过Caco-2细胞的抗炎和抗氧化试验发现，植物乳杆菌J3能够显著降低LPS诱导Caco-2细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6水平(p＜0.05)，显著提高IL-10水平(p＜0.05);有效抑制LPS诱导Caco-2细胞ROS和线粒体超氧化物的产生(p＜0.05),提升LPS诱导Caco-2细胞的线粒体膜电位(p＜0.05)，逆转LPS引起GSR、SOD1、SOD2、GPX2基因mRNA表达水平的下降(p＜0.05);提升LPS诱导Caco-2细胞电阻值，有效缓解LPS引起ZO-1、Occludin、Claudin-l表达水平的下降(p＜0.05)。复筛得到植物乳杆菌J3,为具有优良抗炎能力的菌株。 (2)通过功能基因组研究目标菌株潜在的益菌特性，植物乳杆菌J3全基因组由1条3.14Mb的环形染色体组成，GC含量为44.75％。注释显示3138个蛋白质编码序列(CDS)、16个rRNA和69个tRNAs。比较基因组中显示，16株植物乳杆菌核心基因为1949个，植物乳杆菌J3特有基因196个;系统发育进化树结果中植物乳杆菌J3与16具有最高同源性，共线性分析发现植物乳杆菌J3在进化过程中可能存在部分基因重组和转移。植物乳杆菌J3相关基因中，细胞群落-原核生物（Cellular community-prokaryotes)途径分布最多，其次为膜运输（Membrane transport)、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism)及其他合成代谢途径。其中群体感应、碳水化合物代谢、脂肪酸合成代谢等相关基因对其在胃肠道中发挥益生菌作用提供支持。 3.体内试验主要结果如下: (1)建立肠道黏膜屏障损伤动物模型，造模成功后连续灌胃植物乳杆菌J3菌悬浮液(1×1010CFU/mL)和SASP(50mg/kg)，探宄其治疗效果。DSS模型组体重显著下降(p＜0.05),结肠长度显著縮短(p＜0.05),脾脏指数、DAI显著升高(p＜0.05)，植物乳杆菌J3可有效缓解上述症状。DSS模型组结肠组织肌层和黏膜层结构异常，细胞间缺乏紧密联系，形成多发溃疡，杯状细胞总数显著下降(p＜0.05)，J3组结肠组织黏膜层上皮细胞排列整齐，杯状细胞数量显著增加(p＜0.05)，黏膜下层未见水肿和炎症。与DSS模型组相比，配合J3灌胃后结肠组织中MPO活性、COX-2转录水平和PGE2水平显著降低(p＜0.05)，PGE2浓度升高(p＜0.05);TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著降低、IL-10含量显著提高(p＜0.05);植物乳杆菌J3可显著提升DSS模型组结肠组织MUC2、ZO-1、Occludin和Claudin-1转录水平(p＜0.05)，增加结肠黏蛋白和紧密连接蛋白表达量降低肠道屏障损伤后血清中LPS和D-乳酸浓度(p＜0.05)，优化肠道屏障功能、改善动物模型肠黏膜通透性。 (2)转录组测序分析发现，DSS vs J3共检测到9257个差异表达基因，包括7946个上调差异表达基因和1311个下调差异表达基因。KEGG功能富集分析涉及消化代谢通路有蛋白质消化和吸收、代谢途径、淀粉和蔗糖代谢等，涉及免疫系统的PI3K-Akt信号通路，MAPK信号通路等。 4.植物乳杆菌J3对断奶期北极狐腹泻的防治效果: 断奶应激导致北极狐的腹泻率上升、生长性能下降，试验期内J3组平均日增重显著高于对照组(p＜0.05),腹泻率和腹泻指数显著低于CON组(p＜0.05)。添加植物乳杆菌J3后，北极狐血清IgA、IgM、浓度显著升高(p＜0.05);断后第28天，J3组断奶北极狐血清中IL-1β、TNF-α显著低于CON组，IgG显著高于CON组(p＜0.05)。添加植物乳杆菌J3后，北极狐血清中SOD、T-AOC和GSH-Px活性显著升高(p＜0.05);断后第28天，J3组断奶北极狐血清中GSH-Px活性显著高于CON m(p＜0.05),添加植物乳杆菌J3后，绒毛高度、绒隐比和结肠杯状细胞数量显著增加(p＜0.05),但对隐窝深度无显著影响;结肠组织中Occludin、Claudin1和MUC2转录水平显著升高(p＜0.05)。添加植物乳杆菌J3降低变形菌门（Proteobacteria)、放线菌门（Actinobacteriota)的相对丰度，增加厚壁菌门（Firmicutes)、蓝藻门（Cyanobacteria)的相对丰度。J3组蓝藻纲(Cyanobacteria)中Chloroplast属显著升高、乳杆菌科（Lactobacillaceae)的乳杆菌属和片球菌属（Pediococcus)显著升高、明串珠菌科(Leuconostocaceae)的魏斯氏菌属(Weissella)显著升高。 结论:北极狐出生后肠道微生物多样性随日龄的增加呈波动升高，并受断奶过程影响;乳杆菌目（Lactobacillales)是各肠段优势菌种，断奶后显著下降;需氧或兼性厌氧菌在小肠中占主导地位，厌氧菌在大肠中生长旺盛;断奶前结肠中乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属和Collinsella属占主导地位，断奶后均显著下降。植物乳杆菌J3在细胞水平上具有抗炎潜力，并在分子水平和蛋白水平抑制炎症通路的激活，调节黏膜屏障和菌群平衡，对肠道黏膜屏障损伤动物模型治疗效果显著，饲料中添加植物乳杆菌J3可通过改善北极狐肠道屏障，提高机体免疫功能和抗氧化能力，调节肠道有益菌丰度等途径调节宿主生长发育，缓解北极狐断奶应激。研究结果为养殖生产中防治北极狐腹泻性疾病的微生态制剂提供理论基础，为建立表征新型益生菌提供综合模型，同时为治疗犬科动物肠道黏膜屏障损伤的益生菌开发、机理研究及其临床应用，提供有价值的途径和参考。
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