摘要
D-阿洛酮糖是一种天然存在于各类食物中的稀有单糖，具有低热量、高甜度的特性，被视为蔗糖的理想替代品，在食品、医药和保健等领域具有广阔的应用前景。目前常用的D-阿洛酮糖合成方法是使用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPEase)将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，但是此过程是可逆的，转化效率较低。为了探索其他高效合成D-阿洛酮糖的方法，本论文选用磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖性的醛缩酶合成D-阿洛酮糖。主要研究内容和结果如下: (1)将D-阿洛酮糖的合成途径划分为三个模块，模块Ⅰ:DHAP和D-甘油醛合成D-阿洛酮糖;模块Ⅱ:甘油合成DHAP;模块Ⅲ:甘油合成D-甘油醛。在模块Ⅰ中，对比了大肠杆菌来源的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(RhaD)和L-墨角藻糖-1-磷酸醛缩酶(FucA)，发现FucA的D-阿洛酮糖合成效率高于RhaD，且产物只有D-阿洛酮糖，而RhaD生成的是D-阿洛酮糖和D-山梨糖的混合物。在模块Ⅱ中，分别建立了两条从甘油合成DHAP的途径，途径Ⅰ由甘油激酶(GlpK)和3-磷酸甘油脱氢酶(GlpD)组成，途径Ⅱ由甘油脱氢酶(gldA)和3种不同来源的二羟基丙酮激酶(DAK1、DAK2和dhaM-dhaK-dhaL)组成。对比分析发现途径Ⅰ具有更高的DHAP合成效率。在模块Ⅲ中，为了将甘油转化为D-甘油醛，分别尝试了三种不同来源的醇脱氢酶(AdhA、YahK和AdhP)和一种糖醇氧化酶(AldO)，其中AldO成功地催化甘油转化为D-甘油醛。 (2)基于模块化分析的结果，构建包含GlpK、GlpD、FucA、果糖-1-磷酸酶(YqaB)和AldO的体内级联细胞工厂(KDABO)。以工程大肠杆菌KDABO作为全细胞催化剂，可直接将甘油转化为D-阿洛酮糖，且所得产物只有D-阿洛酮糖，没有D-山梨糖。通过分别增加基因的拷贝数来分析D-阿洛酮糖合成途径的限速节点，发现AldO是酶级联转化途径的关键限速酶，将其编码基因aldO的拷贝数增加一倍，D-阿洛酮糖的产量提高了115.29％。 (3)使用响应面法优化D-阿洛酮糖的合成工艺。进行单因素实验筛选出IPTG浓度、诱导温度、诱导时间、反应温度、反应pH和底物浓度等因素的最佳范围。通过Plackett-Burman试验设计筛选出显著影响因素为诱导温度、诱导时间、反应pH和底物浓度，以D-阿洛酮糖产量为响应值进行Box-Behnken试验设计，对试验结果进行统计学分析并构建数学模型，模型预测的最优条件下D-阿洛酮糖产量为3.14g/L，实验验证结果为3.04g/L。实验验证结果接近预测值，说明模型拟合程度较好。以此为基础在5L发酵罐中进行反应体系的放大，72h后D-阿洛酮糖的产量达到5.67g/L，甘油转化率为11.34％。 综上所述，本论文通过对甘油合成D-阿洛酮糖的途径进行模块化分析，构建了从甘油直接生产D-阿洛酮糖的全细胞催化剂。对合成途径的限速节点进行分析和优化，并使用响应面法优化工艺条件，获得了较高的D-阿洛酮糖产量。为D-阿洛酮糖的高效合成提供了新的选择。
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