摘要
结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率逐年攀升，目前临床治疗手段对患者产生较大的毒副作用，且治愈率低。已有研究揭示靶向药物对CRC疗效显著，且毒副作用少，但靶向药物靶点单一，极易产生耐药性。因此，筛选活性高、特异性强、毒性低、靶点新和药理机制明确的靶向抗肿瘤活性分子已成为抗肿瘤药物研发的焦点。芹菜素是一种广泛存在于蔬菜和水果中的类黄酮，具有抗癌、低毒、无致突变性等特点，极具肿瘤治疗药物开发前景，但芹菜素发挥抗肿瘤效应的分子靶点尚不清楚。 前期研究发现，芹菜素能够通过抑制Ⅱ型丙酮酸激酶（PKM2）的活性来阻断CRC细胞的增殖。然而，PKM2是否是芹菜素发挥抗CRC效应的靶点及二者相互作用的氨基酸位点尚不清楚。本研究的亮点在于阐明了PKM2在芹菜素发挥抗CRC效应中的靶点作用，进一步揭示K433是芹菜素选择性靶向结合PKM2的关键氨基酸位点。本研究证实了芹菜素发挥抗CRC作用的靶点，明确其药理机制，为芹菜素对结直肠癌的精准干预提供新的理论基础和实验依据。研究结果如下： (1)PKM2是芹菜素靶向抗CRC效应的分子靶点。敲低PKM2降低了芹菜素对细胞凋亡的促进作用并逆转了对CRC细胞增殖、克隆形成、及有氧糖酵解的抑制作用，证明芹菜素的抗CRC效应与PKM2的表达量呈正相关。采用Pull-down结合MOLDI-TOF-TOF质谱技术筛选并鉴定芹菜素与CRC细胞中结合的靶点蛋白为PKM2，通过生物层干涉分析技术进一步确定芹菜素能够与PKM2直接相互作用发挥抗CRC效应。 (2)芹菜素能够与PKM2-4效应截短体上K433氨基酸位点结合发挥抗CRC效应。过表达PKM2-4增强了芹菜素的促凋亡作用及其对细胞增殖、克隆形成和有氧糖酵解的抑制作用，证明PKM2-4是芹菜素发挥靶向抗CRC效应的关键结构域；突变PKM2-K433后逆转了芹菜素对CRC细胞的促凋亡作用及其对细胞增殖、克隆形成和有氧糖酵解的抑制作用。进一步揭示芹菜素通过与PKM2-K433结合发挥靶向抗CRC效应。 (3)体内验证芹菜素靶向PKM2-K433氨基酸位点发挥抗CRC效应。过表达PKM2-4增强了芹菜素对Caspase-3的表达以及对裸鼠肿瘤大小、重量和PCNA表达的抑制作用，而突变PKM2-K433削弱了芹菜素的上述抗CRC效应。HE染色显示芹菜素对裸鼠的生长及主要脏器均无毒副作用。结果证明芹菜素靶向PKM2-4效应结构域上K433氨基酸位点在体内发挥抗CRC效应且无毒副作用。 综上所述，本研究揭示了PKM2是芹菜素发挥抗CRC的靶点，进一步证实芹菜素能够与PKM2-4效应截短体上K433氨基酸位点特异性结合，破坏PKM2四聚体到二聚体的形成，抑制结直肠癌的增殖。同时，长期芹菜素干预对裸鼠的体重和活动没有不良影响，表明芹菜素具有作为抗结直肠癌安全有效药物的潜力。
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