摘要
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA（double-stranded,dsRNA）诱发的，靶基因高效特异性沉默的现象。该技术自发现以来被广泛应用于基因功能的研究，并有望成为第四代杀虫剂的核心技术，目前，RNAi效率是限制该技术在害虫防治中应用的关键难题。鳞翅目昆虫对RNAi极不敏感，探究其分子机制，对于鳞翅目害虫绿色防控具有重要的理论与实践意义。本文以鳞翅目昆虫亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）为研究对象，通过系统研究其RNAi分子机制，并与直翅目昆虫飞蝗RNAi分子机制进行对比研究，旨在探究不同昆虫之间RNAi效率差异的原因，为发展提高RNAi效率的策略提供理论依据。主要内容如下： 一、亚洲玉米螟dsRNA降解酶（OfdsRNase）分子特性和功能 通过生物信息学方法，在亚洲玉米螟转录组中鉴定到4个OfdsRNases，分别命名为OfdsRNase1、OfdsRNase2、OfdsRNase3和OfdsRNase4。对其进行生物信息学分析，发现4个OfdsRNases均含有信号肽和Endonuclease NS结构域。随后，利用RT-qPCR技术，检测其在不同发育时期及在五龄幼虫血淋巴和中肠的表达特性，发现OfdsRNase2只在幼虫期高表达，且只在中肠高表达，根据该基因的表达特性，特选择在幼虫期和蛹期进行RNAi，结果显示，在蛹期通过注射dsRNA方法可以成功实现RNAi。进一步通过组织培养、RNAi of RNAi和双荧光素酶实验研究，证明OfdsRNase2可以通过降解dsRNA而影响亚洲玉米螟的RNAi效率。 二、亚洲玉米螟各组织细胞对dsRNA的吸收机制 首先利用注射法，将dsRNA注射到亚洲玉米螟血淋巴，2h后检测各组织细胞对dsRNA的吸收量，结果显示，血细胞吸收最多，表皮次之，而中肠最少。之后选择3种抑制剂，使用抑制剂结合RT-qPCR实验，检测在抑制某内吞通路后，各组织细胞对dsRNA吸收量的变化，结果显示，在抑制网格蛋白介导的内吞通路后，亚洲玉米螟血细胞对dsRNA的吸收量显著减少；在抑制小窝/脂筏介导的内吞通路后，亚洲玉米螟中肠对dsRNA的吸收量显著减少。由此说明，亚洲玉米螟血细胞由网格蛋白依赖的内吞途径吸收dsRNA，而中肠则是通过小窝/脂筏介导的内吞作用吸收dsRNA。 三、亚洲玉米螟RNAi通路核心酶的分子特性及对dsRNA的响应 利用生物信息学方法，在亚洲玉米螟转录组中鉴定到6个RNAi通路核心酶基因，分别为OfDicer1，OfDicer2，OfR2D2，OfAgo1，OfAgo2和OfAgo3，通过RT-qPCR方法，分析各基因在不同发育时期及不同组织部位的表达特性，结果显示，除OfAgo3在幼虫期表达较低以外，其余5个基因在各发育时期和各组织部位均有表达。之后，将dsRNA注射入亚洲玉米螟血淋巴，检测各基因对dsRNA的响应，结果显示，OfDicer2和OfAgo2的表达在注射dsRNA后的各时间点和各组织部位均可被诱导上调。利用这一特性，通过预注射dsRNA的方式激活RNAi通路，从而可以提高靶基因在某些组织的RNAi效率。 四、亚洲玉米螟与飞蝗RNAi效率差异的分子机制 首先，利用体外孵育实验，比较dsRNA在飞蝗和亚洲玉米螟血淋巴和中肠液中的稳定性，结果显示，dsRNA只在飞蝗的血淋巴中保持稳定不被降解。之后，利用组织培养方式，规避其体液对dsRNA的降解作用，而进行后续研究。采用组织培养和RT-qPCR方法，检测飞蝗（Locusta migratoria）和亚洲玉米螟表皮/中肠对dsRNA的吸收效率，结果显示，dsRNA在飞蝗和亚洲玉米螟中的吸收效率无显著差异。最后，利用组织培养RNAi结合小RNA测序技术，发现在飞蝗和亚洲玉米螟中靶基因的沉默效率与被加工的有效siRNA丰度呈正相关，进一步通过碱基偏好性分析，发现与飞蝗相比，亚洲玉米螟对dsRNA剪切具有明显的碱基偏好性，即在5’端NNN/GNN位点切割dsRNA。 综上所述，本文系统研究了dsRNA在亚洲玉米螟中的稳定性、吸收以及剪切特性，发现造成其对RNAi不敏感的主要原因是dsRNA的稳定性及RNAi通路核心酶对dsRNA的剪切特性，本文研究结果不仅阐明了亚洲玉米螟对RNAi不敏感的分子机制，也为RNAi技术在害虫防治中的应用提供了新的思路和方法。
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