摘要
双斑蟋（Gryllus bimaculatus）属无脊椎动物，昆虫纲，直翅目（Orthoptera）不完全变态昆虫，是中国东北、华北、长江下游和华南地区的主要农业害虫。双斑蟋主要危害各种作物的根、茎、叶、果实和种子，严重影响农作物的产量，阻碍农业的发展。 双斑蟋作为直翅目中无卵鞘的代表性物种，在卵期发育的过程中主要依靠浆膜细胞分泌的浆膜表皮完成对其胚胎的保护。因此，可通过干扰其浆膜表皮形成的策略来实施对双斑蟋的防治。根据前人和本实验室早年的研究，发现5种在昆虫表皮形成和排布中起重要作用的基因。本文首先研究了双斑蟋浆膜表皮的功能，然后利用RT-qPCR技术以不同发育时期的双斑蟋胚胎cDNA为模板，分析双斑蟋浆膜表皮几丁质形成及排布的关键基因Chitin synthase1（CHS1）、Chitin deacetylase1（CDA1）、Chitin deacetylase2（CDA2）、Knickkopf（Knk）和Retroactive（Rtv）的时空表达谱，利用免疫组化染色对以上关键基因在胚胎中的表达进行定位，最后采用RNAi技术研究这5个关键基因在双斑蟋浆膜表皮几丁质形成及排布过程中的功能以及其在环境适应中的作用，主要研究内容具体如下： 一、双斑蟋浆膜表皮的形成与功能 收集1h内双斑蟋新产的卵进行培养，每隔12h通过显微镜观察双斑蟋胚胎发育情况，从而了解胚胎发育的整个过程，采用HE染色、透射电镜观察双斑蟋浆膜表皮的形成过程。通过以上几种方法观察总结浆膜表皮的结构特征，发现双斑蟋浆膜表皮在胚胎发育的E2H12开始形成，到E4H12开始降解，成熟的浆膜表皮结构为电子密度非均质的片层状结构。用强氧化剂NaClO处理浆膜表皮形成前后的双斑蟋卵，结果表明浆膜表皮形成后强氧化剂NaClO只能溶解最外层的卵壳并不能降解浆膜表皮，说明双斑蟋浆膜表皮具备对强氧化剂的耐受能力。此外，将发育至不同时期的双斑蟋卵放置在不同湿度条件（15%RH、50%RH、95%RH）下培养并观察卵的存活率，发现浆膜表皮形成后放入不同条件下的卵的存活率均较高，表明浆膜表皮提高了双斑蟋卵抵抗干燥环境的能力。综上所述，双斑蟋浆膜表皮具有维持卵的发育、抵抗强氧化剂和干燥环境等功能。 二、双斑蟋几丁质形成及排布关键基因表达定位 Chitin synthase1（CHS1）、Chitin deacetylase1（CDA1）、Chitin deacetylase2（CDA2）、Knickkopf（Knk）和Retroactive（Rtv）是与昆虫表皮形成有关基因。为了了解以上关键基因在双斑蟋浆膜表皮发育过程中的表达情况，采用RT-qPCR技术分析各基因的时空表达情况，结果显示，GbCHS1、GbCDA1、GbCDA2在E2H12、E3H0表达量最高，GbKnk和GbRtv从E2H0开始高表达，随后不同发育点的表达量差异不显著。几丁质形成及排布关键基因的高表达时间与HE染色、透射电镜所观察到的浆膜表皮开始形成的时间相吻合，推测GbCHS1、GbCDA1、GbCDA2、GbKnk和GbRtv在双斑蟋浆膜表皮形成过程中起至关重要的作用，他们共同参与了浆膜表皮的形成。另通过免疫组化法确定几丁质形成及排布关键基因GbCHS1、GbCDA1、GbCDA2、GbKnk和GbRtv在双斑蟋浆膜表皮发育过程中的表达定位，结果表明：GbCDA1在浆膜细胞质中表达，GbCDA2在浆膜细胞质和表皮层中表达，GbKnk在浆膜细胞质中表达，GbRtv和GbCHS1在细胞核、浆膜细胞质、表皮层中皆有表达。 三、双斑蟋几丁质形成及排布基因功能研究及其在胚胎环境适应性中的作用 为了研究双斑蟋几丁质形成及排布基因的功能，本文首先采用RNAi技术检测其沉默效率，同时观察对照组（注射dsGFP）和处理组（注射dsGbCDA1、dsGbCDA2、dsGbKnk、dsGbRtv、dsGbCHS1）双斑蟋卵的表型，结果显示：RNAi之后，和对照组相比，处理组的5个基因皆被显著沉默，且处理组的卵表现出发育延迟或死亡。另外采用HE、免疫组化、透射电镜分析以上关键基因被干扰之后，蛋白表达信号的强弱以及浆膜表皮厚度、结构的变化，结果显示：注射dsGbCDA1、dsGbCDA2、dsGbKnk、dsGbRtv、dsGbCHS1的卵中各蛋白表达均较对照组的弱；透射电镜结果发现注射dsGbKnk的双斑蟋浆膜表皮变薄，且无层状结构形成，注射dsGbCDA2的浆膜表皮的层状结构较对照组松散；注射dsGbCDA1、dsGbRtv后浆膜表皮变薄但仍有不明显的层状结构。此外，分别干扰上述基因后再将卵放入干燥环境中，发现与对照组相比，处理组的双斑蟋卵对干燥环境的耐受性显著降低。
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