摘要
结肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率位居第三、死亡率位居第二的癌症。铁是一种必需的微量元素，是多种酶的辅因子，并参与细胞氧化还原过程，是机体生理功能的重要组成物质之一。研究表明，铁与结肠癌密切相关，铁过量可促进结肠癌的发生发展，然而大多数结肠癌患者伴有缺铁性贫血，引起身体机能下降。口服补铁是临床治疗缺铁性贫血常用策略，但结肠癌患者获益有限，因而亟需发展结肠癌患者缺铁性贫血的治疗策略。 目的：复方苦参注射液（Compound Kushen Injection，CKI）是治疗结肠癌常用的辅助药物，课题组前期通过探索性研究发现硫酸亚铁增强CKI对SW480结肠癌细胞的生长抑制作用。本课题依据前期发现，充分阐明铁剂增敏CKI抗结肠癌的作用，并探索其作用机制，提供了一种补铁但不促癌的口服补铁策略。 方法： 1.为了明确铁剂增敏CKI抗结肠癌的作用，首先采用SRB法评价铁剂对CKI体外抗结肠癌活性的影响，并通过Combenefit软件分析药物联用的协同/拮抗作用；其次应用显微观察细胞形态和3D细胞成球实验，检测药物对细胞形态和细胞成球生长的影响。 2.为了阐明铁剂联用CKI抗结肠癌的效应机制，首先采用Calcein-AM和PI荧光双染色法标记活细胞和死细胞，其次利用细胞死亡途径抑制剂探索细胞死亡方式，以及EdU染色法评价细胞增殖能力；最后通过细胞周期同步化结合显微观察检测处于有丝分裂期细胞的数量。 3.为了探索铁剂联用CKI抗结肠癌的关键作用靶点，首先基于网络药理学挖掘介导铁剂和CKI联用抗结肠癌的潜在关键基因，其次利用western blot验证铁剂和CKI对潜在关键基因的调节作用，最后采用关键基因的蛋白特异性小分子调节剂确定潜在关键基因在铁剂和CKI协同抗结肠癌中的作用。 结果： 1.SRB实验表明，铁剂——硫酸亚铁（FeSO4）和柠檬酸铁铵（FAC），分别增强CKI对SW480和HCT116结肠癌细胞的体外抗肿瘤活性。其中，FAC联用CKI对SW480细胞的生长抑制作用更强。显微镜观察和3D细胞成球实验，进一步证实FAC增强CKI对SW480细胞的生长抑制作用。以上结果表明，铁剂增强CKI的体外抗结肠癌活性。 2.Calcein-AM和PI荧光双染色法结果表明，FAC和CKI联用降低SW480的活细胞数量并增加死细胞数量。进一步，铁死亡、坏死性凋亡、细胞焦亡、细胞凋亡和细胞自噬抑制剂，对FAC和CKI联用的体外抗结肠癌活性没有显著影响，表明FAC和CKI联用不通过诱导细胞死亡发挥抗肿瘤作用。EdU染色表明，FAC联用CKI明显抑制SW480细胞的增殖。并且，FAC和CKI联用减少SW480细胞周期M期细胞的数量。以上结果表明，铁剂和CKI联用通过抑制细胞增殖而非诱导细胞死亡发挥抗结肠癌活性。 3.通过网络药理学，预测出FAC和CKI联用抗结肠癌的潜在关键靶点144个，并通过western blot验证发现FAC降低TOP2A蛋白表达，CKI降低p53蛋白表达。进一步，TOP2A抑制剂VP16和CKI、FAC和p53蛋白降解剂SAHA、FAC和p53转录激活抑制剂pifithrin-a，协同发挥体外抗结肠癌活性，明确TOP2A和p53是铁剂和CKI协同抗结肠癌的关键靶点。 结论：铁剂和CKI通过分别降低TOP2A和p53的表达，协同抑制结肠癌细胞增殖，发挥抗结肠癌作用。本文为结肠癌患者缺铁性贫血的治疗提供了一种策略：口服铁剂和复方苦参注射液，为复方苦参注射液的二次开发研究和升级改造提供了潜在的临床应用方向。
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