摘要
外周神经损伤是常见的慢性临床疾病，导致患者肢体功能障碍，甚至致残、致瘫。外周神经系统在损伤后具备一定的修复能力，这与外周神经系统中施旺细胞的存在与功能密切相关。施旺细胞通过发育、分化，形成成髓鞘施旺细胞和非成髓鞘施旺细胞，维持神经系统内环境稳态。一旦外周神经发生病变，施旺细胞能立即响应一系列程序，动态协助外周神经再生和修复，在外周神经疾病治疗领域开展对施旺细胞的研究具有重要意义。 Ezrin蛋白作为ERM（Ezrin、Radixin、Moesin）蛋白家族重要的一员，是连接细胞膜和细胞骨架微丝的关键分子，广泛分布于各种组织细胞。Ezrin参与众多信号通路调控，如Rho/ROCK、MAPK/ERK、PI3K/Akt等，调节细胞增殖、迁移和细胞形态塑造等。Ezrin包括3个区段，分别为N端的FERM结构域，中段的α-螺旋区域和C端的C-ERMAD结构域。C-ERMAD结构域中567位苏氨酸（Thr567）是调节Ezrin活性状态的关键磷酸化位点。Ezrin表达于施旺细胞微绒毛处，促进施旺细胞髓鞘化过程中郎飞氏结的形成。 本文首先研究了Ezrin对施旺细胞髓鞘化的调节。在大鼠施旺细胞（RSC96）中对Ezrin基因干扰和过表达，通过qRT-PCR技术、MMT法、Western blot实验、细胞划痕实验以及细胞免疫荧光实验，观察到Ezrin表达下调能够显著抑制RSC96细胞的增殖和迁移能力，降低转录因子Krox20和髓鞘化相关蛋白P0及L-periaxin表达，引起细胞形态由双极化向多极化转变。过表达Ezrin明显提高RSC96细胞迁移能力和髓鞘化相关蛋白表达。ROCK抑制剂Y27632能够降低Ezrin的Thr567磷酸化水平，有效抑制RSC96细胞迁移能力，下调Krox20、P0及L-periaxin表达，增加RSC96细胞多极化形态。Ezrin表达下调或Ezrin的Thr567磷酸化水平降低，均能抑制PI3K、Akt及ERK的活性，提示Ezrin调节施旺细胞髓鞘化涉及PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路。此外，在损伤的大鼠坐骨神经组织中干扰Ezrin表达，加剧了髓鞘的脱落与崩解，相反地，过表达Ezrin能促进髓鞘再生与修复。 在施旺细胞中，L-periaxin蛋白定位在细胞膜附近，介导PDG（L-periaxin-DRP2-Dystroglycan）复合物及L-periaxin-Integrinβ4复合物，参与Cajal带的形成，对髓鞘发育、成熟至关重要。L-periaxin还被发现在人类大脑内皮细胞调节血脑屏障渗透性，在晶状体纤维细胞中与Ezrin形成复合物维持细胞正常形态。本文利用免疫荧光染色观察到Ezrin与L-periaxin在施旺细胞膜和髓鞘远轴膜存在明显共定位。采用双分子荧光互补、免疫共沉淀、海肾荧光素酶双分子互补、荧光光谱滴定等技术，结合分子对接对Ezrin与L-periaxin结合的具体区段分析。结果显示Ezrin FERM结构域的F3亚结构域和L-periaxin的NLS3区域结合，介导Ezrin与L-periaxin的N端相互作用；Ezrin(475-557)和L-periaxin(1368-1461)结合，介导Ezrin与L-periaxin的C端相互作用。竞争性免疫共沉淀实验显示Ezrin和L-periaxin的相互作用可抑制L-periaxin自身首尾结合。干扰RSC96细胞中Ezrin的表达引起L-periaxin从细胞膜向细胞质转移。Y27632抑制剂处理RSC96细胞同样引起L-periaxin在细胞膜定位减少，细胞质定位增加。而Ezrin的Thr567模拟磷酸化可促进L-periaxin在细胞膜定位。在损伤的大鼠坐骨神经组织中过表达Ezrin可引导L-periaxin正确定位于再生髓鞘的远轴膜处。 蛋白质液-液相分离被视为一种调控蛋白质快速集散的新型、高效的方式。细胞中蛋白质相分离对生物体生理活动有调控作用。本文在RSC96、HEK293、HeLa、N2a及COS7细胞中过表达GFP-Ezrin，观察到GFP-Ezrin可以蛋白聚集点的形式普遍定位于细胞膜附近。激光共聚焦显微镜检测到GFP-Ezrin聚集点可发生融合，荧光漂白恢复实验揭示GFP-Ezrin聚集点具备液态性质，为蛋白液滴。对Ezrin进行原核表达纯化，在5%PEG8000的诱导下，Ezrin可在体外发生相分离，形成的蛋白液滴在荧光漂白后具有荧光恢复能力。进一步将Ezrin的FERM结构域原核表达纯化，观察到其在体外自发地聚成蛋白液滴。通过浑浊度检测、离心沉降实验及蛋白浓度、盐浓度依赖性检测，表征了Ezrin的FERM结构域存在相分离的能力。 综上所述，本研究为Ezrin蛋白在外周神经系统施旺细胞中发挥作用的进一步探索提供参考。Ezrin蛋白液-液相分离为理解其在生物体内调节复杂生理活动的机制提供了新的思路。
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