摘要
背景： 汉滩病毒（Hantaanvirus，HTNV）是肾综合征出血热的病原体。目前肾综合征出血热的治疗以对症治疗为主，尚缺乏有效抑制HTNV复制且毒副作用小的药物。研究发现黑种草籽及其有效化学成分百里醌（Thymoquinone，TQ）能有效抑制多种微生物感染。本文拟从体内、外两个层面，研究TQ对HTNV感染的抑制作用，并深入探讨TQ对HTNV感染激活的TLR4/NF-kB信号通路及其炎症因子表达的影响，揭示TQ抑制汉滩病毒感染的靶点，为探索TQ的新的生物学活性以及TQ作为抗HTNV的药物提供实验依据。 方法： （1）TQ抑制HTNV在宿主细胞内的复制及其机制。 1.通过MTT（四唑盐)比色法检测药物作用后的细胞存活率，确定TQ对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的细胞毒性。 2.从抗生物合成、直接杀伤、抗吸附作用、预防作用等四种作用方式确认TQ的抑制病毒复制的效应。 3.采用实施定量PCR（RT-qPCR）、蛋白免疫印迹（WesternBlot）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法检测各组细胞中TLR4、NF-kB的表达或激活并检测IL-6、IP-10下游炎症因子在细胞内外的表达。 （2）TQ对HTNV感染动物的保护作用。 1.建立HTNV感染动物模型。将2日龄BaLb/C乳鼠颅内接种不同滴度的HTNV，通过观察乳鼠生存率、平均生存天数，明确HTNV感染乳鼠LD50。 2.用低（5mg/kg/d）、中（10mg/kg/d）、高（20mg/kg/d）不同浓度TQ和利巴韦林（10mg/kg/d）分别腹腔注射感染HTNV乳鼠，通过观察病毒感染乳鼠生存率、体重变化、组织中病毒核酸、病毒蛋白改变等，综合评价TQ抗病毒效果以及对病毒感染乳鼠的保护作用。 3.分别于感染后3d、5d、7d、9d、12d收集乳鼠组织（脑、肺、肾），通过组织切片HE染色，观察乳鼠组织病理改变，初步探索TQ对HTNV感染动物炎症因子表达的影响。 结果： 1.TQ在25μM浓度范围内，HUVECs存活率大于80%，且TC50为118.7μM。 2.TQ通过抗生物合成作用抑制HTNV在HUVECs中的复制，而不是通过直接杀伤、抗吸附、预防三种方式抑制HTNV感染。此外TQ抑制HTNV感染呈剂量依赖效应与时间依赖效应。IC50为8.96μM，TI值为13.26。 3.TQ能抑制HTNV感染引起的TLR4/NF-kB通路激活并且降低其下游炎症因子IL-6和IP-10表达。 4.50LD50HTNV感染乳鼠经TQ处理后体重下降、精神萎靡、被毛粗乱、反应性增高、弓背、尾鞭样改变、后腿麻痹瘫痪和震颤痉挛等症状出现均延迟，平均生存天数亦延长，其中中浓度（10mg/kg/d）TQ延长平均生存天数时间最长（1.6d），但其效果不及阳性对照药物利巴韦林（延长了2.6d）。 5.感染HTNV乳鼠脑、肺组织中病毒载量随感染天数而不断增加；与病毒感染组相比，低、中、高浓度TQ处理组HTNV感染乳鼠体内脑和肺组织病毒载量明显降低；HTNV感染第12d乳鼠脑、肺组织中，中浓度TQ组病毒抑制效率分别为23.18%±6.36%和35.72%±1.04%，而利巴韦林组病毒抑制效率则分别为50.49%±2.73%和59.76%±3.51%。 6.HE染色切片显示TQ减轻了乳鼠中由于病毒感染诱导造成的脑、肺、肾组织中炎症损伤。 结论： TQ可抑制HTNV在HUVECs中复制，并且TQ通过抑制TLR4/NF-kB通路发挥抗炎作用。进而动物实验验证TQ能延长乳鼠生存时间且降低HTNV感染乳鼠炎症反应。
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